吳求生,龍 健,*,李 娟,廖洪凱,劉靈飛,吳勁楠,肖 雄

1 貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室,貴陽 550001 2 貴州師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,貴陽 550001

微生物是地球最早出現(xiàn)的生命形式,其出現(xiàn)決定了地球演化的方向和進程,推動了土壤的發(fā)生和發(fā)育[1],不少學(xué)者從不同角度、利用不同技術(shù)手段對農(nóng)田及森林土土壤微生物進行了大量研究[2-4],得出一系列成果；土壤微生物參與土壤有機質(zhì)的分解與積累以及氮、磷等元素的轉(zhuǎn)化過程[1,5],這一系列過程受到多種因素綜合影響。研究土壤微生物分布特征與土壤理化性質(zhì)關(guān)系及其對土壤環(huán)境變化的響應(yīng)機制,對進一步明確其生態(tài)過程具有重要意義。

喀斯特環(huán)境是我國西南山區(qū)一個獨特的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng),與黃土、沙漠、寒漠并列為我國四大生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū)[6-7]?？λ固厣絽^(qū)地表破碎、土壤淺薄、分層復(fù)雜,且大多數(shù)土壤留存于地表發(fā)育的石縫、石洞、石溝等小生境中,使得喀斯特地區(qū)原本有限的土壤資源顯得彌足珍貴[8]。近年來,針對喀斯特地區(qū)小生境分布的特點,學(xué)者們主要圍繞小生境土壤理化性質(zhì)、類別、以及代表性取樣方法等進行系統(tǒng)研究,結(jié)果表明喀斯特地區(qū)小生境土壤理化性質(zhì)存在極強地空間異質(zhì)性[9-13]。土壤微生物對環(huán)境變化敏感度高,小生境土壤空間異質(zhì)性以及水熱狀況的差異,勢必對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。然而,目前針對喀斯特地區(qū)不同小生境類型是如何影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性的研究,鮮有報道。

茂蘭喀斯特原始森林位于貴州省荔波縣境內(nèi),是目前世界上同緯度地區(qū)喀斯特原生性森林分布面積最大的地區(qū),該地區(qū)分布著復(fù)雜的生境類型,對整個西南喀斯特地區(qū)具有較好的代表性。本研究以茂蘭保護區(qū)原始森林小生境為研究對象,探討不同小生境類型對土壤微生物群落組成特征的影響,結(jié)合多元回歸樹(Multivariate Regression Tree,MRT)分析方法對小生境類型進行聚類,分析不同小生境間的區(qū)別和聯(lián)系。旨在了解喀斯特地區(qū)小生境土壤微生物分布特征及其對土壤環(huán)境變化響應(yīng)機制,為喀斯特山區(qū)微生物多樣性保護及石漠化防治提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域概況

貴州荔波茂蘭國家級喀斯特自然保護區(qū)地處107°52′—108°05′E,25°09′—25°20′N。年均溫度18.3℃,≥10℃積溫5767.9℃,全年降水量1320.5 mm,集中分布于4—10月；年均相對濕度8%；年均霜日7.3 d；全年日照時數(shù)1272.8 h；屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候,實驗區(qū)喀斯特森林主要為常綠和落葉種群混生格局,主要樹種有：中華蚊母樹(Distyliumchinense)、青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)、圓果化香(Platycaryalongipes)、多脈榆(Ulmuscastaneifolia)、黃連木(Pistaciachinensis)、掌葉木(Handeliodendronbodinieri)、翅莢香槐(Cladrastisplatycarpa)、香葉樹(Linderacommunis)等,喬灌層郁閉度達0.95,群落高度約8—12 m；區(qū)內(nèi)主要出露巖石為純質(zhì)石灰?guī)r和白云巖,與常態(tài)地貌相比,生境復(fù)雜多樣,有石面、石溝、石洞、石槽、石縫、土面等小生境[13-14]。另外,區(qū)內(nèi)土壤以黑色石灰土為主,土層淺薄不連續(xù),富含有機質(zhì)及其他營養(yǎng)物質(zhì)(氮、磷、鉀、鈣等)[15]。

1.2 采樣方法與指標測定

于2017年春季進行野外考察并采集土壤樣品。因采樣區(qū)地形為坡度走向形勢,為縮小因微地貌等自然條件帶來的采樣誤差,樣地的選擇以小生境集中程度為前提。為探索喀斯特山區(qū)土壤理化性質(zhì)及微生物在垂直水平上的特點,特對土面進行分層采集樣品,根據(jù)為土壤顏色分層,把土面厚度約為0—10 cm的土層約定為土面表層,厚度為約10—20 cm的土層約定為土面下層,石溝、石槽、石洞等生境的土壤淺薄,無明顯分層現(xiàn)象,因此未對此類生境土壤分層采集。共選取3個樣方(20 m×20 m),每個樣方6類小生境：石溝、石洞、石槽、石縫、土面表層(top-soil,約為0—10 cm)、土面下層(sub-soil,約10—20 cm),每個類型采3—5個土樣,共采集69個小生境土樣。每個樣方同類型生境土壤均勻混合,最后共計18個樣品。用無菌袋封裝20 g左右,用于測定磷脂脂肪酸(帶回實驗室后,充分混勻無菌袋中土樣,過2 mm篩,混勻,以四分法取樣,一周內(nèi)測),其余樣品帶回實驗室后,分成兩部分,一部分土樣自然風(fēng)干,用于測土壤總碳、總氮及pH等指標；一部分保存在4℃冰箱備用。

土壤總碳、總氮采用元素分析儀Vario micro cube(Elementar)測定：風(fēng)干土樣,過0.149 mm尼龍篩,取適量樣品置于鋁盒中,烘箱60℃經(jīng)8 h去除水分,冷卻,稱量140—160 mg,其中,石槽和石溝土壤碳含量過高,因此稱取40—50 mg,上機測定；有機質(zhì)測定采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法[16]；pH測試采用玻璃電極法。

微生物測定采用磷脂脂肪酸生物標記法[17]：稱取適量冷凍干燥土于離心管中,按順序加入檸檬酸緩沖液、氯仿、甲醇；渦旋振蕩,遮光振蕩2 h,離心,轉(zhuǎn)移；加入檸檬酸緩沖液、氯仿,振蕩,間隔放氣,遮光隔夜靜置,4℃保存；吸除上層緩沖液(廢液),下層氯仿相轉(zhuǎn)移,氮氣吹干；萃取(SPE),轉(zhuǎn)移并加入甲醇,氮吹；加甲醇甲苯混合液,溶解磷脂,加氫氧化鉀溶液,水??；加正己烷氯仿混合液、醋酸、去離子水,振蕩、離心,將上層有機相轉(zhuǎn)移至小試管；加正己烷氯仿混合液,重復(fù)提取,振蕩、離心,轉(zhuǎn)移上層有機相至小試管,氮吹干；正己烷溶解磷脂脂肪酸甲酯,轉(zhuǎn)移至GC內(nèi)插管中,上機測(Agilent7890B)。

標記的脂肪酸與土壤微生物對應(yīng)關(guān)系見表1。磷脂脂肪酸計算用峰面積和內(nèi)標曲線法[18],內(nèi)標為19:0,含量用nmol/g表示。

表1 微生物指示脂肪酸

i、a、cy、Me表示異、反異、環(huán)丙基和甲基分枝脂肪酸;ω、c分別表示脂肪端順式空間構(gòu)造

1.3 數(shù)據(jù)處理

主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)對物種變量降維,降維結(jié)果被投影在二維坐標上,可清楚地看出物種在樣方中分布情況及組成特征,本研究利用PCA分析不同小生境類型對土壤微生物特征PLFA分布和組成特征的影響。

MRT以小生境土壤理化因子為分類節(jié)點,利用二歧式分割法,將微生物種類和含量定義的生境逐步劃分為同質(zhì)性高的組。每一次劃分都是以某一土壤理化因子的某個值將小生境分成兩個部分,使得節(jié)點左右兩組組內(nèi)小生境微生物差異盡量小,組間差異盡量大,然后對劃分出來的小生境以同樣方式繼續(xù)分組,直至分割結(jié)果滿足某種條件而終止[26]。MRT可利用交叉驗證對分類結(jié)果進行“剪枝”,以得到數(shù)量合適的樹,“1SE”準則[27-28]是常用于確定樹的大小的方法。

實驗數(shù)據(jù)運用Excel和SPSS 22.0軟件進行處理,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)檢驗各指標在不同類型生境中的差異情況,顯著水平設(shè)為P= 0.05；PCA分析、MRT分析分別用R語言(https://www.r-project.org)程序包vegan[29]和MVPARTwrap[30]進行。用Origin2017軟件和R語言作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小生境類型對土壤理化性質(zhì)的影響

小生境土壤有機質(zhì)變化范圍在60—546 g/kg,石槽有機質(zhì)含量顯著高于其他小生境(P<0.05)(表2)；不同小生境類型土壤pH存在較大差異,總體上呈石縫>石洞>石槽>土面表層>石溝>土面下層的趨勢；總碳在小生境中呈現(xiàn)規(guī)律與有機質(zhì)一致；石槽總氮含量顯著高于石溝,石溝顯著高于其他生境；石槽碳氮比顯著高于土面下層,與其他生境呈差異不顯著。

表2 小生境土壤理化性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差,同一列不同小寫字母表示小生境間達顯著差異水平(P<0.05)

2.2 不同小生境土壤微生物的PLFA分析

2.2.1 不同小生境對土壤PLFA種類和總量的影響

6種小生境中共檢測到48種PLFA生物標記,其中,石溝土壤中有47種,總含量為(296.45±23.18) nmol/g；土面表層有40種,總含量為(234.21±22.60) nmol/g；石洞土壤有44種,總含量為(206.96±50.18) nmol/g；石縫土壤有43種,總含量為(155.74±83.93) nmol/g；石槽土壤有39種,總含量為(388.34±73.82) nmol/g；土面下層有35種,含量為(127.04±71.81) nmol/g；6種小生境土壤完全分布的PLFA有30種,如14:00、15:00、16:00、14:0 iso、15:0 iso、16:0 iso等,不完全分布的PLFA有18種,如24:00、14:0 iso、21:1 ω8c、21:1 ω3c、22:1 ω3c、23:1 ω4c等未見分布于土面下層,但在其余生境中均被檢測出,17:1 ω8c僅出現(xiàn)在石槽中,19:1 ω7c 10-methyl僅出現(xiàn)在石溝中。土面下層PLFA含量顯著低于土面表層、石溝以及石槽,與石洞、石縫PLFA含量差異不顯著(圖1)。

從總體上看,不同生境類型土壤PLFA基本以16:00(細菌)、15:0 iso(革蘭氏陽性菌)、16:0 iso(革蘭氏陽性菌)、18:1 ω7c(革蘭氏陰性菌)、18:1 ω9c(真菌)、19:0 cyclo ω7c(未知)、16:0 10-methyl(放線菌)、18:0 10-methyl(放線菌)等PLFA類型為主,這8種PLFA相對含量占總PLFA相對含量的70%。

圖1 不同小生境土壤PLFA種類和總量統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 The type of PLFA and total contents in different microhabitats of soil土表指土面表層(top-soil),土下指土面下層(sub-soil)

2.2.2 不同小生境土壤微生物特征PLFA主成分分析

對不同小生境土壤微生物特征PLFA進行主成分分析,結(jié)果見圖2。第一主軸和第二主軸分別解釋土壤特征PLFA方差的52.29%和25.36%；石槽PLFA含量最高,其次是石溝,最后是土面下層,但石縫和土面下層的16:0 anteiso、18:1 ω5c、18:2 ω6c、16:0 iso、17:0 iso以及17:0 anteiso等特征PLFA相對含量高于石溝和石槽。石槽、石縫以及土面下層離坐標原點較遠,石溝和土面表層離坐標原點較近。

圖2 不同小生境土壤特征PLFA的主成分分析Fig.2 Principal components analysis of specially PLFA in soil of different microhabitats

2.2.3 不同小生境對土壤特征微生物類群PLFA含量的影響

石槽土壤微生物總量顯著高于其他生境類型(P<0.05),并且其他生境間兩兩差異不顯著；真菌含量在土面下層、石縫、石洞、土面表層等生境中表現(xiàn)為差異不顯著,在土面下層、石溝、石槽中表現(xiàn)為差異顯著；放線菌分布規(guī)律與真菌類似；細菌分布規(guī)律與微生物總量分布一致；土面下層的G+含量與石縫、石洞及土面表層的土壤G+含量表現(xiàn)為差異不顯著,與石溝、石槽表現(xiàn)為差異顯著；G-在不同生境類型中分布情況與微生物總量、細菌分布規(guī)律相同；土面下層的G+/G-值高于其他生境類型,與石槽、石溝、土面表層及石縫表現(xiàn)為差異顯著；真菌/細菌變幅為0.14—0.16,具體表現(xiàn)為土面表層>石縫>石溝>石槽>石洞>土面下層,在6種生境類型中兩兩間呈差異不顯著?？傮w上,土壤微生物總量、細菌、真菌、放線菌、G+、G-含量均表現(xiàn)為石槽>石溝>土面表層>石洞>石縫>土面下層。

圖3 不同小生境土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成特征Fig.3 Composition of soil microbial community structure in different microhabitats

2.3 不同小生境土壤微生物與理化因子的相關(guān)性

不同小生境土壤微生物及其比值與理化因子相關(guān)性分析結(jié)果見表3。

表3 小生境土壤微生物與理化因子的相關(guān)性

*表示P<0.05,**表示P<0.01

圖4 MRT分析簡要圖Fig.4 A summary tree of the MRT analysis (1)：圖中Ogm:有機質(zhì),Organic matter；(2)R2表示回歸樹對物種方差解釋比例；(3)誤差表示回歸樹不能解釋的方差比例；(4)CV誤差表示交叉驗證誤差；(5)圖中帶有()的數(shù)字表示節(jié)點；(6)：節(jié)點下方的百分比表示環(huán)境因子對該節(jié)點中微生物組成方差解釋比例；(7)：樹葉中n為小生境個數(shù)

土壤微生物總量、細菌、真菌、放線菌與有機質(zhì)、總碳、總氮呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與碳氮比呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；G+與有機質(zhì)、總碳、總氮呈顯著正相關(guān)(P<0.05),G-與有機質(zhì)、總碳、總氮呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；5種微生物及其總量均與pH呈負相關(guān),但未達到顯著水平(P>0.05)；G+/G-與pH呈正相關(guān),與有機質(zhì)、總碳、總氮以及碳氮比呈負相關(guān),并且與碳氮比達到顯著水平；真菌/細菌與pH、有機質(zhì)、總碳、總氮以及碳氮比均呈正相關(guān),但未達到顯著水平。

2.4 基于MRT分析的小生境類別劃分

對回歸樹進行“剪枝”結(jié)果見圖4,18個小生境被分為5組,每組包含小生境個數(shù)和類型見表4?；貧w樹共解釋了76.59%的物種方差,說明回歸樹模型解釋能力較好。節(jié)點(1)將18個生境分為2組(樹左右兩邊),并解釋了物種組成方差的49.76%,有機質(zhì)作為樹第一次劃分樣點的條件,說明有機質(zhì)是影響樣點分組和微生物分布的首要因子,節(jié)點(1)左邊組與右邊組分別含5個、13個生境,節(jié)點(2)以有機質(zhì)為劃分條件對節(jié)點(1)右邊組13個生境進行分組,節(jié)點(6)和節(jié)點(12)分別以碳氮比和pH為劃分條件繼續(xù)對生境分組?；贛RT聚類結(jié)果,本研究將茂蘭喀斯特森林小生境劃分為4大類,即：石槽-石溝型,石洞-石縫型,土面表層型以及土面下層型。

表4 MRT樹葉小生境分組表

3 討論

3.1 不同小生境類型對土壤理化性質(zhì)的影響

西南喀斯特山區(qū)溶蝕作用十分強烈,小生境類型多樣,土壤性質(zhì)因小生境環(huán)境的不同(光、熱和水分條件)存在強烈異質(zhì)性,且增加了在水平方向上的變異[12]。本研究顯示,小生境土壤有機質(zhì)變化范圍在60—546 g/kg,與劉方等[13]研究結(jié)果基本一致；有機質(zhì)、總碳、總氮含量表現(xiàn)為石槽>石溝>土面表層>石洞>石縫>土面下層,主要由于石槽、石溝、土面表層生境狀態(tài)較石洞、石縫開放,使植被凋落物和雨水極易累積,凋落物的分解速率受不同小生境水熱狀況的影響,凋落物的分解是土壤有機質(zhì)的來源,直接影響土壤有機質(zhì)的含量[12,31]；土壤pH在生境中呈石縫>石洞>石槽>土面表層>石溝>土面下層的趨勢,這主要是由于石縫、石洞等小生境成土過程以巖石風(fēng)化為主[13],因此這兩種生境類型土壤pH較其他生境高；土壤中胡敏酸含量與有機質(zhì)含量呈正相關(guān),胡敏酸含量越高,土壤pH越趨向微酸性[32],本研究中土壤有機質(zhì)含量最高的石槽、石溝也表現(xiàn)出pH較低的特點。

3.2 不同小生境類型對土壤微生物組成的影響

研究顯示,茂蘭喀斯特森林小生境土壤微生物PLFA總量與細菌PLFA含量均表現(xiàn)為石槽>石溝>土面表層>石洞>石縫>土面下層。石溝、石槽及土面表層等生境中的植物根系及凋落物分布較其他生境多,這些物質(zhì)能改變土壤的碳輸入,因此石溝、石槽以及土面表層等生境中土壤微生物獲得的碳源更加充沛,碳源充足的生境中,土壤微生物種類和含量較豐富。MRT分析結(jié)果顯示,微生物群落組成主要受土壤有機質(zhì)影響,該結(jié)果與吳愉萍[32]對土壤微生物與有機質(zhì)關(guān)系研究結(jié)果一致。

真菌和放線菌PLFA含量表現(xiàn)為石槽>石溝>土面表層>石洞>石縫>土面下層,而真菌、放線菌與有機質(zhì)、碳、氮以及碳氮比呈顯著正相關(guān)。這說明有機質(zhì)及氮的水平影響著真菌和放線菌的含量。另外,真菌/細菌可用于估算真菌和細菌的相對豐度,其比值的大小可指示微生物群落穩(wěn)定性[33]。本研究顯示,真菌/細菌變幅為0.14—0.16,其中土面表層的真菌/細菌值最大,說明土面表層的生物群落較其他生境穩(wěn)定。G-是復(fù)合營養(yǎng)型微生物,G+是寡營養(yǎng)型微生物[34],G+/G-值越大,表明土壤養(yǎng)分越貧瘠。本研究中,G+/G-變幅為0.43—0.87,石槽的比值最小,土面下層最大,說明石槽土壤養(yǎng)分最豐富,土面下層養(yǎng)分最為貧瘠。小生境土壤營養(yǎng)豐富意味著微生物含量亦豐富。

微生物除了參與土壤中元素循環(huán)和能量流動外,在巖石溶蝕過程中亦具有重要功能,如微生物分泌胞外聚合物,附著在巖石表明并形成一個特殊的環(huán)境,實現(xiàn)礦物的溶出,而巖石溶蝕是喀斯特山區(qū)成土的重要方式；另外,生物附著于土壤中可以阻止土壤風(fēng)化過程的養(yǎng)分淋溶作用,從而使?fàn)I養(yǎng)元素得以保存,土壤微生物在這一過程中扮演著重要角色[35-36]。這一系列生態(tài)過程對喀斯特山區(qū)成土理論研究以及土地石漠化治理具有重要現(xiàn)實意義。

3.3 小生境類別劃分

本研究將茂蘭喀斯特森林小生境劃分為石槽-石溝型、石洞-石縫型、土面表層型以及土面下層型,與廖洪凱等[12]使用冗余分析法對貴州喀斯特山區(qū)花椒林小生境分類結(jié)果較類似,但與劉方等[13]對茂蘭喀斯特森林小生境分類研究結(jié)果差異較大,在劉方等人的研究中,是以小生境土壤理化因子為變量,基于歐氏距離對小生境聚類；本文運用的MRT聚類方法兼顧了小生境土壤微生物和理化因子兩種變量,所含信息量大,冗余分析屬約束排序范疇,側(cè)重于對物種變量的解釋,缺少對樣方分類的概念[37]。因此,MRT聚類結(jié)果更為合理；另外,MRT分組結(jié)果顯示了不同生境類型組合的情況,可能是因為不同生境類型土壤之間存在過渡性質(zhì)。

本研究與已有研究對比發(fā)現(xiàn),小生境分類結(jié)果差異較大的原因除了所用分類方法不同,還由于不同研究區(qū)域小生境外部特征差異較大引起[12-13,38],這種差異給研究者在野外布設(shè)樣點和采集土樣時帶來困擾。目前,在針對喀斯特山區(qū)土壤的研究中,野外布設(shè)樣點和土樣采集往往忽視了因小生境的存在而使土壤性質(zhì)存在極為強烈的空間異質(zhì)性,導(dǎo)致布設(shè)的點和采集的樣品難具代表性。為此,王世杰等[32]建議以小生境面積權(quán)重衡量某個小生境對同類型生境混合土樣量的貢獻,以提高土壤樣品的代表性,該方法具有一定的科學(xué)性,但加大了野外工作量；另外,劉方等人[13]提出將土面和石溝的土壤代表喀斯特土壤,但其認為此方案需要深入探討。本研究運用的MRT聚類方法,計算時納入了土壤理化因子及微生物數(shù)據(jù),包含樣方信息量較傳統(tǒng)聚類方法更加全面,而且能對存在過渡性質(zhì)的樣方進行分類[39]。因此,本研究聚類結(jié)果更為合理。從而建議以小生境組合的方式代替單獨小生境類型,以供今后在喀斯特山區(qū)土壤研究布設(shè)樣點和土樣采集中使用,可以有效地解決上述問題。研究以單因素方差分析法分析土壤環(huán)境因子和微生物的組成差異,結(jié)果表明理化因子和微生物在土面表層和土面下層未見顯著差異,但在MRT模型聚類結(jié)果中,土面表層和土面下層并未被聚為同組,加之喀斯特山區(qū)土壤淺薄不連續(xù)、分層不明顯等特點,可以初步認為這兩類生境的土壤理化因子和微生物極有可能存在較復(fù)雜的聯(lián)系,這方面有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究表明,貴州茂蘭喀斯特森林不同小生境類型土壤理化性質(zhì)存在顯著地空間異質(zhì)性。小生境土壤理化性質(zhì)的變化使得微生物群落結(jié)構(gòu)以及群落穩(wěn)定性層次分明。多元回歸樹聚類結(jié)果表明,小生境可劃分為石槽-石溝型、石洞-石縫型、土面表層型以及土面下層型四種生境類型。因此,在今后對喀斯特地區(qū)土壤微生物研究中,應(yīng)充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)等技術(shù)手段加深對森林土壤微生物的研究,可在喀斯特山區(qū)生物多樣性保護及石漠化治理中起到重要作用。