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(1.山西省農(nóng)科院果樹研究所,山西 太谷 030815; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,山西 太谷 030801)

水楊酸(Salicylic acid,SA),即鄰羥基苯甲酸,是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡(jiǎn)單酚類化合物。研究表明,SA可誘導(dǎo)植物體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)及系統(tǒng)抗病性的獲得[1],是植物抗病反應(yīng)的信號(hào)分子和誘導(dǎo)植物對(duì)非生物逆境反應(yīng)的抗逆信號(hào)分子[2],而且在植物生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老調(diào)控及抗逆誘導(dǎo)等方面,也具有廣泛的生理作用。

在逆境條件下,植物體內(nèi)代謝失調(diào),活性氧和自由基含量升高[3],而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等是植物體內(nèi)清除活性氧重要的保護(hù)酶,避免了自由基對(duì)有機(jī)體的攻擊和傷害,尤其是生物膜[4]。丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物之一,其含量的高低是反映脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。此外,MDA還可與膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合,引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián),使之失活,破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,從而使生物表現(xiàn)出傷害狀態(tài)[5]。SOD、POD、CAT能夠抑制逆境引發(fā)的丙二醛(MDA)積累[6],從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定和完整,提高對(duì)逆境的適應(yīng)性。因此,保護(hù)酶活性的高低及MDA的含量在一定程度上反映植物的耐逆境的能力[7]。

黃愛(ài)霞和佘小平[8]發(fā)現(xiàn),SA能夠提高SOD、POD的活性減緩膜脂中過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累,從而提高了黃瓜幼苗的抗低溫能力。宋士清等[9]研究表明,外源SA能夠顯著增強(qiáng)SOD、POD和CAT等保護(hù)酶活性,降低黃瓜的鹽害指數(shù),MDA含量和電解質(zhì)滲漏率,從而誘導(dǎo)黃瓜幼苗的抗鹽能力。王偉英等[10]研究SA處理能夠提高水仙葉片中SOD和CAT的活力,對(duì)衰老過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧起到有效的清除作用。王麗等[11]研究外源SA能明顯提高葡萄幼苗在抗寒鍛煉期間根、莖中SOD,POD活性,降低質(zhì)膜相對(duì)透性和MDA含量,增強(qiáng)了幼苗的抗寒性,且1.00 mmol/L SA處理表現(xiàn)最為明顯。詹妍妮等[12]研究認(rèn)為:外源SA和熱鍛煉都能顯著降低膜脂過(guò)氧化水平,在噴施100 μmol/L SA后,葉肉細(xì)胞的MDA和O2-含量顯著降低,膜脂相對(duì)透性減小,保護(hù)酶系SOD、CAT活性都明顯升高。上述研究表明,SA能夠誘導(dǎo)SOD、POD、CAT活性的增強(qiáng),抑制MDA積累,從而誘導(dǎo)植物抗逆性的產(chǎn)生。

本試驗(yàn)通過(guò)外源噴施SA,闡明SA對(duì)葡萄葉片SOD、CAT活性及MDA含量的影響,為采用SA提高植物抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為長(zhǎng)勢(shì)良好、土壤和管理?xiàng)l件一致的15株赤霞珠葡萄,分為5組,選擇植株中上部位成熟葉片進(jìn)行標(biāo)記,對(duì)植株進(jìn)行SA處理,濃度分別為0.00 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.50 mmol/L、5.00 mmol/L,噴施時(shí)間為上午8時(shí),在葉片表面不再濕潤(rùn)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),分別在30 min,60 min,90 min,120 min采樣。

1.2 試驗(yàn)試劑與用具

試驗(yàn)試劑主要有:三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑(NBT)、核黃素、EDTA、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸二氫鈉、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、濃鹽酸、30%H2O2。

試驗(yàn)用具主要有:TV-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、離心機(jī)、制冰機(jī)、天平、研缽、試管、容量瓶、量筒、燒杯、玻璃棒、移液管、洗耳球、石英比色皿、溫度計(jì)、離心管、移液槍、試管架、剪刀、鑷子等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SOD活性測(cè)定 采用NBT光還原法,以抑制NBT光化學(xué)還原50%的酶量為1個(gè)酶活力單位。剪取0.1 g葡萄葉片,置于研缽中,加入1 mL 50 mM pH 7.8磷酸緩沖液,加少量石英砂,冰上研磨,做3份重復(fù),分別轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管,12 000 rpm冷凍4℃離心15 min,取上清液供酶活測(cè)定。取17支大試管,各加入5 mL NBT反應(yīng)液,從15份酶液中各取10 μL分別加入15支中,搖勻。另外2支為對(duì)照,1支對(duì)照管保存于暗處,作為參比;另1支對(duì)照管和15支樣品管在25 ℃下光照20 min后,在560 nm波長(zhǎng)下比色。樣品酶活單位=[(照光對(duì)照管的吸光值-樣品管的吸光值)×酶液提取液總體積]÷(1/2×照光對(duì)照管的吸光值×樣品鮮重×測(cè)定時(shí)所用的酶液體積),樣品酶活單位表示:SOD酶活單位/g FW。

1.3.2 CAT活性測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定。稱取葡萄葉片1.00 g 置于預(yù)冷的研缽中,加入5 ml(分兩次加入)預(yù)冷的 pH 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂,冰浴研磨成勻漿后,轉(zhuǎn)入 10 ml離心管中,在4 ℃、15 000 rpm下離心15 min,上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。取4支10 ml試管,分別加 2 ml酶提取液于沸水浴中加熱煮死,冷卻備用。再取4支10 ml試管,3支為測(cè)定(3個(gè)重復(fù)),1支為對(duì)照,按要求加入試劑[Tris-HCl 1.0 ml,酶液 0.025 ml(對(duì)照組為煮死酶液),蒸餾水 1.7 ml]。然后將上述4支試管于25 ℃水浴中預(yù)熱3 min,逐管加入 0.2 ml 200 mM 的 H202溶液,每加1管立即在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定A240(蒸餾水調(diào)零),每隔30 s讀數(shù)1次,共測(cè)3 min,記錄4支試管的測(cè)定值。結(jié)果計(jì)算:以1 min內(nèi)A240降低0.1(3支測(cè)定管的平均值)為1個(gè)酶活性單位(U),先求出3支測(cè)定管各自1 min內(nèi)A240降低值,按下式計(jì)算CAT活性。CAT活性(U·g-1FW·min-1)=(ΔA240×Vt)÷(0.1×Vs×t×FW) 式中ΔA240=As0-(As1+As2+As3)÷3;As0:煮死酶液對(duì)照管吸光度;As1、As2、As3:樣品測(cè)定管吸光度;Vt:酶提取液總體積(mL);FW:樣品鮮重(g)。

1.3.3 丙二醛含量測(cè)定 稱取0.4 g鮮重的葉片,加入少許石英砂和2 mL 0.1%三氯乙酸(TCA),充分研磨成勻漿后移到試管中,再用3 mL 0.1%三氯乙酸(TCA)分兩次沖洗研缽,合并提取液,每個(gè)樣作2個(gè)重復(fù);在提取液中加入5 mL 0.5%的硫代巴比妥酸溶液,搖勻;將試管放入沸水浴中顯色反應(yīng)15 min,到時(shí)間后立即取出并放入冰浴中冷卻至室溫;冷卻后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中3 000 rpm離心15 min,取上清液,測(cè)定其體積,以0.5%的硫代巴比妥酸溶液為參比,測(cè)532 nm和600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。結(jié)果計(jì)算:MDA含量(m mol/g FW)=[(532 nm吸光值-600 nm吸光值)×上清液總體積]÷[155×稱取植物材料的鮮重]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2003分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪制折線圖、利用SAS進(jìn)行方差數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SA對(duì)葡萄葉片SOD活性的影響

由圖1可以看出,外源SA對(duì)葉片超氧化物歧化酶SOD影響比較明顯,在處理后30 min到60 min時(shí),各濃度處理都成上升趨勢(shì),尤其是0.50 mmol/L處理時(shí)增長(zhǎng)趨勢(shì)較好,且高于其他濃度的處理,60 min后低濃度處理組仍成上升趨勢(shì),高濃度2.5 mmol/L和5.00 mmol/L開(kāi)始下降,在90 min后各處理組的葉片SOD活性都為下降趨勢(shì),說(shuō)明外源SA對(duì)葡萄葉片SOD活性的影響先成上升然后下降的趨勢(shì),又由表1可知處理為0.50 mmol/L在60 min時(shí)對(duì)葡萄葉片SOD活性影響顯著。

圖1 外源SA對(duì)葡萄葉片SOD活性的影響

表1 SOD方差分析表Tab1. The analysis of variance of SOD

2.2 外源SA對(duì)葡萄葉片CAT活性的影響

由圖2可以看出,外源SA處理后對(duì)葡萄葉片CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì),促進(jìn)了活性氧自由基的清除,而且在較低濃度的SA處理對(duì)CAT的活性影響較大,增長(zhǎng)較快,濃度過(guò)高時(shí)作用不明顯,但在90 min后都有上升。在表2中可知0.50 mmol/L和1.00 mmol/L處理在120 min與對(duì)照相比差異顯著。

圖2 外源SA對(duì)葡萄葉片CAT活性的影響

2.3 外源SA對(duì)葡萄葉片丙二醛含量的影響

由圖3可知外源SA處理葉片后對(duì)膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量有一定的影響,呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),與對(duì)照組相比0.50 mmol/L處理組的MDA含量下降趨勢(shì)較大,在處理后120 min時(shí)達(dá)到最低值。在表3中可以看出0.50 mmol/L處理組與對(duì)照組相比差異顯著。

圖3 外源SA對(duì)葡萄葉片MDA含量的影響

表2 CAT方差分析表Tab.2 The analysis of variance of CAT

表3 MDA方差分析表

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)外源噴施SA,以赤霞珠葡萄(VitisviniferaL.cv.Cabernet Sauvignon)為試材,對(duì)不同濃度SA處理后葡萄葉片SOD、CAT、MDA的變化情況進(jìn)行了初步研究,得出以下結(jié)論:

1)外源噴施SA后,葡萄葉片SOD活性先增強(qiáng),在處理后90 min開(kāi)始下降,而且SA濃度在0.50 mmol/L時(shí)SOD活性變化比較顯著。

2)外源噴施SA后,葡萄葉片CAT活性呈上升趨勢(shì),0.50 mmol/L和1.00 mmol/L處理后上升效果顯著。

3)外源噴施SA后,葡萄葉片MDA含量變化有下降的趨勢(shì),且在0.50 mmol/L處理組下降幅度明顯。

在正常條件下,植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡,而當(dāng)處于逆境脅迫時(shí),這一平衡被破壞而產(chǎn)生過(guò)多的自由基,植物為了適應(yīng)進(jìn)而繼續(xù)生存逐漸進(jìn)化出一套適應(yīng)機(jī)制和策略,使自身免受逆境傷害,隨即產(chǎn)生兩種系統(tǒng)防止活性氧的危害:酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。植物的酶促防御系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等,都具有清除自由基的能力,減輕膜質(zhì)過(guò)氧化程度。前人研究[13-15]表明,外源SA可提高植物體內(nèi)SOD活性,但SA對(duì)CAT活性的影響尚有爭(zhēng)議,Dat等[16]報(bào)告,外源水楊酸培養(yǎng)煙草植株降低了CAT活性,此結(jié)果在擬南芥[17]馬鈴薯微植體[18]和葡萄[19]中得到證實(shí)。但Rao等[13]和李兆亮等[14]研究認(rèn)為,SA對(duì)CAT活性無(wú)顯著抑制作用;而何亞麗等[15]研究表明,0.5 mmol/L的水楊酸有提高高羊茅幼苗CAT活性的作用。詹妍妮等[12]用1年生赤霞珠葡萄幼苗噴施100 μmol/L的SA后,其葉肉細(xì)胞的CAT活性明顯升高。在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)赤霞珠葡萄成熟葉片噴施0.50 mmol/L的SA后,其葉肉細(xì)胞的CAT活性也明顯升高,進(jìn)一步說(shuō)明SA對(duì)CAT有促進(jìn)作用。王利軍等[20]研究表明,葡萄幼苗葉片噴施SA 1 h后,MDA含量就有顯著降低,之后雖有增高,但直到噴后24 h,仍比未噴施的低,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。