孫麗慧 李倩 蔣榮響 林鋒

摘要：從患病擬穴青蟹（Scylla paramamosain）肝胰腺中分離到2種優(yōu)勢菌株，對(duì)2種優(yōu)勢菌株進(jìn)行了鑒定和特性分析。利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析和16S rDNA序列測定法對(duì)細(xì)菌類別進(jìn)行判定，并采用藥敏試驗(yàn)對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，這2種細(xì)菌分別為弧菌（Vibrio sp.）和希瓦氏菌（Shewanella），利用15種抗生素對(duì)2種細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)2種細(xì)菌對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素高度敏感，對(duì)其他幾種抗生素則有一定的耐受性。研究進(jìn)一步證實(shí)了海水致病性弧菌是擬穴青蟹細(xì)菌性疾病高發(fā)的主要原因，也表明希瓦氏菌可能是一種潛在病原菌，與弧菌協(xié)同作用，對(duì)擬穴青蟹規(guī)模化養(yǎng)殖造成危害，同時(shí)也為擬穴青蟹養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性病害的確定和防治提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：擬穴青蟹（Scylla paramamosain）;弧菌（Vibrio sp.）;希瓦氏菌（Shewanella）;16S rDNA;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S943? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）俗稱青蟹，具有生長快、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，是中國東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類之一[1]。近年來，青蟹養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴(kuò)大，但由于養(yǎng)殖配合飼料相對(duì)滯后，冰鮮餌料極易導(dǎo)致水質(zhì)惡化，從而導(dǎo)致青蟹病害日趨嚴(yán)重[2，3]。目前，青蟹常見病害主要有病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病[4]。其中，已報(bào)道的細(xì)菌病主要致病菌有非液化摩拉氏菌[5]、辛辛那提弧菌[6]、溶藻弧菌[6]、副溶血性弧菌[6]、嗜水氣單胞菌[7]、溫和氣單胞菌等[8]。由于細(xì)菌的復(fù)雜性、多樣性，在一定條件下給青蟹養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。然而中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)種類繁多，水生生物學(xué)基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后，導(dǎo)致許多病因無法判定，故無法采用有效措施進(jìn)行防治?；【╒ibrio sp.）是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動(dòng)物體內(nèi)。其致病性受宿主的生理狀態(tài)及水質(zhì)環(huán)境條件等綜合因素的影響較大，是一類條件致病菌。近年來，由于養(yǎng)殖水域生態(tài)變化，弧菌已成為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌之一。目前，作為海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病原菌已有較多報(bào)道[9-19]。希瓦氏菌屬（Shewanella）為革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，具單一極生鞭毛，DNA的G+C含量為43%～55%。腐敗希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌是人類和其他生物的潛在病原菌，國內(nèi)外相繼報(bào)道了有關(guān)希瓦氏菌感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物的研究[20-24]。隨著研究深入，淡水養(yǎng)殖動(dòng)物感染希瓦氏菌的病例也陸續(xù)有了相關(guān)報(bào)道[25-27]。這說明該菌所具有的潛在致病性對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖形成嚴(yán)重威脅，所以必須對(duì)該病原菌給予足夠的重視。因此，本研究通過對(duì)患病青蟹體內(nèi)病原菌分離、16S rDNA序列分析鑒定病原菌的類別，并利用藥敏試驗(yàn)來初步篩選治療該病的藥物，開展典型性青蟹病癥的研究，有利于針對(duì)不同的病癥采取有效的治療措施，降低經(jīng)濟(jì)損失。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品來源? 2017年6月取自浙江省三門縣綠洋特種水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，送檢樣品除1只存活外均已死亡，外部觀察無明顯病癥。解剖結(jié)果，肉體略發(fā)紅，鰓明顯發(fā)黑，已死亡青蟹肝胰腺有明顯性腫大。

1.1.2? 培養(yǎng)基及試劑? 營養(yǎng)肉湯干粉、瓊脂干粉、細(xì)菌理化特征性鑒定用的培養(yǎng)基和藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司;革蘭氏染色液購自南京建成生物工程研究所;PCR擴(kuò)增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)菌分離? 在無菌條件下，用酒精棉球擦拭患病青蟹體表后進(jìn)行解剖，取血、心、肝胰臟和腸等組織樣品，分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板（pH 7.4）上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)12 h，根據(jù)菌落特征，挑取單菌落劃線分離。

1.2.2? 細(xì)菌形態(tài)觀察? 將分離菌接種于培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)12 h，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3? 16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析? 16S rDNA基因序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增片段大小為1 470 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL、模板菌液3 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。根據(jù)分離菌的核苷酸測序結(jié)果，利用NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進(jìn)行序列同源性比較，采用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，采用鄰接法（Neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹方法，并通過Boot-strap法檢驗(yàn)。

1.2.4? 藥敏試驗(yàn)? 藥物敏感性試驗(yàn)按紙片擴(kuò)散法[28]進(jìn)行，測定抑菌圈直徑，并參照NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)[29]進(jìn)行敏感性判定。檢測的抗生素包括慶大霉素、氟苯尼考、萬古霉素、卡那霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、新霉素、多粘菌素B、拉氧頭孢、阿米卡星、復(fù)方新諾明、妥布霉素、呋喃唑酮和頭孢唑啉等15種。

1.2.5? 致病性試驗(yàn)? 將分離菌以3 000 r/min離心收集沉淀，用已經(jīng)滅菌的0.85%生理鹽水，吹打懸浮制成細(xì)菌懸液。選取規(guī)格相近（150 g）的擬穴青蟹40只，每10只為1組，3組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組。分別給每只青蟹注射0.1 mL細(xì)菌懸液（濃度約為1×109 CFU/mL）;對(duì)照組每只僅注射0.1 mL無菌生理鹽水，相同環(huán)境下分別隔離飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 細(xì)菌的形態(tài)特征

從患病青蟹肝胰臟組織中分離到2種優(yōu)勢菌，分別標(biāo)記為QX170601和QX170602。其中，細(xì)菌QX170601菌體短小、彎曲成弧形或直桿狀，具有一端單一鞭毛，初步判定為革蘭氏陰性菌;細(xì)菌QX170602菌體短桿狀，彎曲，菌落酪黃色，較小，光滑，邊緣規(guī)整，略凸起，初步判定為革蘭氏陰性菌。

2.2? 細(xì)菌16S rDNA序列鑒定

利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了菌株的核苷酸序列。將核苷酸測序結(jié)果通過Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株QX170601和QX170602與弧菌和希瓦氏菌同源性高達(dá)99%，選擇同源性較高的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育學(xué)樹，再結(jié)合QX170601和QX170602的菌落形態(tài)、革蘭氏染色情況可以基本判定QX170601為弧菌屬，而QX170602與希瓦氏菌為同一屬的細(xì)菌。

2.3? 藥敏試驗(yàn)

選取常用的15種抗生素藥敏紙片，對(duì)弧菌和希瓦氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，QX170601和QX170602同時(shí)對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素高敏，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、頭孢唑啉、多粘菌素B、復(fù)方新諾明中度敏感，此外QX170602還對(duì)拉氧頭孢、阿米卡星、妥布霉素中度敏感，對(duì)其他抗生素有一定耐藥性（表1）。

2.4? 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

青蟹分別接種細(xì)菌QX170601、QX170602以及QX170601與QX170602的混合懸液。1 d后觀察發(fā)現(xiàn)注射菌液的3組青蟹均出現(xiàn)活力下降癥狀，第4天后，注射JS1501-JS1502混合菌液組青蟹開始出現(xiàn)死亡，直至第7天全部死亡;而第7天注射QX170601的死亡率約為60%;QX170602組死亡率僅為20%，而對(duì)照組一直沒有出現(xiàn)死亡。結(jié)果表明，分離菌QX170601具有明顯致死率，在與QX170602的協(xié)同作用下毒力更強(qiáng)（表2）。

3? 小結(jié)與討論

在青蟹病原菌的診斷過程中，采用了目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增法[30，31]，再結(jié)合經(jīng)典的革蘭氏染色法、負(fù)染電鏡觀察法，通過細(xì)菌形態(tài)觀察和核酸鑒定，對(duì)從患病青蟹分離到的2種菌株進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地判定，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，這兩種菌具有較強(qiáng)的耐藥性。

近年來，隨著青蟹養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，青蟹病害日趨嚴(yán)重。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)弧菌和希瓦氏菌屬于條件性致病菌，如青蟹配合飼料缺乏，冰鮮魚投喂，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境不佳時(shí)可誘發(fā)青蟹感染，從而導(dǎo)致青蟹體色發(fā)白，活動(dòng)能力明顯減弱，攝食量減少或不攝食。針對(duì)目前青蟹養(yǎng)殖種的病害現(xiàn)狀，一方面要注重前期重大病原檢測，如苗種引進(jìn)時(shí)可進(jìn)行規(guī)范性檢測，降低和杜絕病原的攜帶，從源頭上進(jìn)行防范;另一方面，針對(duì)條件性致病菌，要防止養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，降低條件性致病菌的暴發(fā)率，并對(duì)高致死率的病原菌進(jìn)行綜合防治，長期、連續(xù)抽樣監(jiān)測，進(jìn)行防控，也要制備相應(yīng)的疫苗和有效的藥物進(jìn)行細(xì)菌病的阻斷遏制。

本研究目的在于對(duì)致死率較高、暴發(fā)面較廣的青蟹病原菌進(jìn)行確診鑒定，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為致病菌的防控提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，便于病害防控?cái)?shù)據(jù)庫的建立。

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