■ 汪夢(mèng)昀 繆禮鴻* 勵(lì) 飛 劉蒲臨 廖衛(wèi)芳

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.湖南九鼎科技（集團(tuán)）有限公司，湖南長沙410000）

β-甘露聚糖（β-Mannan）普遍存在于植物性飼料中，如棕櫚粕、瓜兒豆粕、椰子粕等，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，不易消化降解，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[1]。β-甘露聚糖酶（β-Mannanase）是一類能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖主鏈的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類，在動(dòng)植物和微生物中廣泛存在。作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖[2]，在食品、飼料、醫(yī)藥、造紙、紡織、印染等多方面廣泛應(yīng)用[3]。

來源于微生物的β-甘露聚糖酶具有高活性、高產(chǎn)量、低成本、易培養(yǎng)和易提取等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對(duì)β-甘露聚糖酶發(fā)酵的研究主要集中于細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、嗜堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)；真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger)、木霉(Trichoderma.)；以及放線菌中的鏈霉菌(Streptomycetaceae)等[4]。不同菌株來源的β-甘露聚糖酶性質(zhì)不同，可分為酸性、中性和堿性的β-甘露聚糖酶[5]。

本研究從南方土樣中篩選得到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶較高的益生芽孢桿菌，通過優(yōu)化其搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件有效提高了其產(chǎn)酶水平，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步分析，為β-甘露聚糖酶的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)及新的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

海南省某森林采集的土樣，無菌袋密封保存。

1.1.2 藥品與試劑

魔芋膠、魔芋精粉、魔芋微粉（湖北強(qiáng)森魔芋科技有限公司）；甘露糖、甘露聚糖、刺槐豆膠：色譜純（Sigma）；棕櫚粕、豆粕[湖南九鼎科技（集團(tuán)）有限公司]；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純（上海國藥集團(tuán)）。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（g/l）：棕櫚粕（粉碎過40目篩）150，pH值自然。

選擇培養(yǎng)基（g/l）：魔芋膠5、蛋白胨10、NaCl 5、K2HPO41、MgSO40.5、瓊脂 10，pH值7.5。

種子培養(yǎng)基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5，pH值7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：魔芋膠 7、蛋白胨 5、(NH4)2SO45、MgSO40.3、KH2PO42、NaCl 1，pH值6.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶芽孢桿菌的篩選與鑒定

1.2.1.1 菌株的篩選

取5 g海南地區(qū)土樣，于100 ml無菌水中浸泡過濾，制成土壤懸液。向土壤懸液中加入15 g棕櫚粕，75℃水浴處理20 min后，于37℃，150 r/min，富集培養(yǎng)3 d，梯度稀釋涂布于選擇培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h。用1 g/l的剛果紅染液染色10 min，再用1 mol/l的NaCl溶液洗滌2～3次[6]。觀察透明圈，測(cè)量并記錄H/C值，同時(shí)劃線分離得到單菌落。

選取上述透明圈較大的菌株接入種子液培養(yǎng)基，37℃、170 r/min培養(yǎng)12 h后，按5%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。取發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.1.2 菌株的鑒定

對(duì)篩選得到的β-甘露聚糖酶活力較高的菌株，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提DNA，用16 S rDNA通用引物27 F(5c-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3c)和1492 R(5c-AAGGAGGTGATCCAGCC-3c)對(duì)目標(biāo)菌株的16 S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，送至生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種屬。

1.2.2 β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定

參照蒙海林等[7]的方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Akino等[8]的DNS法，以5 g/l的魔芋粉為底物（0.2 mol/l，pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），測(cè)定β－甘露聚糖酶活，一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol D-甘露糖所需的酶量。

1.2.3 產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化

1.2.3.1 不同碳源及碳源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，依次改變碳源為7 g/l的葡萄糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、魔芋膠、魔芋精粉、魔芋微粉及刺槐豆膠，37℃、170 r/min發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量OD600，考察不同碳源物質(zhì)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。每個(gè)處理做三個(gè)平行，以下試驗(yàn)同。

依次調(diào)整碳源的添加量為2、4、6、8、10 g/l，其余條件不變，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同的碳源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.2 不同氮源及氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

確定碳源及其濃度后，以初始發(fā)酵培養(yǎng)基中5 g/l蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別添加與其相等含氮量的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4、NH4NO3及豆粕粉作為氮源（見表1），發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同氮源物質(zhì)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

表1 氮源類型

依次調(diào)整氮源的添加量為2、4、6、8、10 g/l，其余條件不變，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同的氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.3 不同無機(jī)鹽及其濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

確定碳、氮源及其濃度后，分別添加0.5 g/l的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、NaCl、CaCl2，以 不添加無機(jī)鹽作為空白對(duì)照（CK），發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同無機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響[9]。

隨后依次調(diào)整 K2HPO4的添加量為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/l，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同濃度的K2HPO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。確定K2HPO4的濃度后，依次調(diào)整MgSO4的添加量為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/l，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同濃度的MgSO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。確定MgSO4的濃度后，依次調(diào)整CaCl2的添加量為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/l，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同濃度的CaCl2對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.4 起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

確定培養(yǎng)基各組分及含量后，依次調(diào)節(jié)起始pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.5 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

確定發(fā)酵培養(yǎng)基后，依次調(diào)節(jié)接種量為1%、2%、3%、4%、5%、6%，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.6 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

確定最佳接種量后，將250 ml錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量依次調(diào)整為20、40、60、80、100、120 ml，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.7 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

控制培養(yǎng)溫度分別為28、30、34、37、40 ℃，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.3.8 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

控制恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速分別為 120、150、170、180、200、220 r/min，發(fā)酵24 h后測(cè)定β-甘露聚糖酶活力及菌株生物量，考察不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.4 菌株96 h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶及生長動(dòng)態(tài)變化

以最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)定發(fā)酵液甘露聚糖酶活力及菌株生物量?？疾炀戤a(chǎn)酶及生長動(dòng)態(tài)變化[10]，以酶活力最高點(diǎn)作為后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定取樣時(shí)間。

1.2.5 產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面優(yōu)化

1.2.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

采用spss軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，選取對(duì)菌株WMYB-2發(fā)酵產(chǎn)β－甘露聚糖酶影響最顯著的三個(gè)因素設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken（BB）實(shí)驗(yàn)[11]。因素的選取水平見表2，以碳源濃度（A），氮源濃度（B），與pH值（C）為試驗(yàn)因素，β－甘露聚糖酶活力為響應(yīng)值（R），其余因素根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)、大小以及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正效應(yīng)的因素取高水平濃度，負(fù)效應(yīng)的因素取低水平濃度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.2.5.2 產(chǎn)酶最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)BB實(shí)驗(yàn)及Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)回歸方程在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)產(chǎn)酶最佳條件的預(yù)測(cè)培養(yǎng)基組分及濃度，進(jìn)行產(chǎn)酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三個(gè)平行試驗(yàn)取平均值，與RSM回歸模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較與分析。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 溫度對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響

取適當(dāng)稀釋的酶液，分別置于35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴反應(yīng)，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力，以最高酶活力為100%，考察不同溫度對(duì)酶活力的影響。每個(gè)處理做3個(gè)平行，以下實(shí)驗(yàn)同。

將適當(dāng)稀釋的酶液分別置于45、50、55、60℃的恒溫水浴鍋中保溫0.5、1、2、3 h后，在55℃測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，考察溫度對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響。

1.2.6.2 pH值對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響

用pH值4.0～10.0（pH值4.0～8.0，0.2 mol/l的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH值9.0～10.0，0.2 mol/l的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）的緩沖液配制不同pH值的底物，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力，以最高酶活力為100%，考察不同pH值對(duì)酶活力的影響。

將等量適當(dāng)稀釋的酶液與pH值4.0～10.0的緩沖液混勻，置于55℃恒溫水浴鍋中保溫2 h，測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，考察pH值對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響。

1.2.6.3 金屬離子及其他化合物對(duì)酶活力的影響

將適當(dāng)稀釋的酶液與終濃度為2 mmol/l的Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+金屬離子溶液及0.1 mol/l的EDTA和SDS溶液混合，于55℃保溫1 h后，測(cè)定殘余酶活力[12]，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，考察不同金屬離子及其他化合物對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的分離與鑒定

2.1.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

按1.2.1.1節(jié)的方法分離得到8株可降解魔芋膠產(chǎn)生透明圈的初篩菌株，透明圈（H/C）值以及β-甘露聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果如表3所示。選取其中產(chǎn)透明圈最大、酶活力最高的一株命名為WMYB-2[圖1(c)]。該菌株菌落為乳白色、不透明、表面光滑、較濕潤、中間與邊緣厚薄不一、邊緣呈鋸齒狀、易挑取，菌落直徑大小約4.04 mm[圖1(a)]，菌體呈短桿狀，長約0.5 μm，革蘭氏染色陽性[圖1(b)]。

表3 透明圈（H/C）值及酶活力測(cè)定結(jié)果

圖1 菌株WMYB-2的菌落形態(tài)、革蘭氏染色及透明圈平板

2.1.2 產(chǎn)酶菌株的鑒定

在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，菌株WMYB-2與Gene Bank中登錄的B.subtilisZGL14菌株（登錄號(hào)：MH 362700.1）的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%，初步確定為枯草芽孢桿菌，用MEGA 5.2構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

2.2 產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

魔芋微粉作為碳源時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果最優(yōu)（P＜0.05），魔芋精粉次之，刺槐豆膠與魔芋膠誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果較好，而其他碳源物質(zhì)幾乎不誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶，如圖3(a)所示，因此選擇魔芋微粉為最佳碳源。

菌株生物量及產(chǎn)酶量隨著碳源濃度的升高而迅速升高，如圖3(b)所示，當(dāng)碳源濃度為6 g/l時(shí)菌株生物量OD600達(dá)到最高，隨后降低，此時(shí)產(chǎn)酶效果次之；當(dāng)碳源濃度為8 g/l時(shí)產(chǎn)酶效果達(dá)到最優(yōu)（P＜0.01）；碳源濃度繼續(xù)增大，培養(yǎng)基黏度隨之增大且呈膠狀，影響菌株生長產(chǎn)酶，因此選擇8 g/l為最佳碳源濃度。

2.2.2 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖2 菌株WMYB-2的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 碳源種類（a）及魔芋微粉濃度（b）對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖4(a)所示，大豆蛋白胨作為氮源時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果最優(yōu)（P＜0.05），豆粕、胰蛋白胨、牛肉膏等次之，因此選擇大豆蛋白胨為最佳氮源。菌株生物量及產(chǎn)酶量隨著氮源濃度的升高而升高，如圖4(b)所示，當(dāng)?shù)礉舛葹? g/l時(shí)，產(chǎn)酶及菌株生物量達(dá)到最高（P＜0.05），隨后降低；當(dāng)?shù)礉舛葹? g/l時(shí)，產(chǎn)酶效果次之，因此選擇8 g/l為最佳氮源濃度。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖5(a)所示，與不添加無機(jī)鹽(CK組)相比，各無機(jī)鹽對(duì)菌株WMYB-2產(chǎn)酶的影響依次為：CaCl2＞MgSO4＞K2HPO4＞NaCl＞KH2PO4＞(NH4)2SO4。 選 擇 對(duì) 菌株產(chǎn)酶的影響相對(duì)較顯著的三種無機(jī)鹽，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng)K2HPO4濃度為0.8 g/l時(shí)，產(chǎn)酶效果最優(yōu)且菌株生物量達(dá)到最高[圖5(b)]；當(dāng)MgSO4濃度為1.0 g/l時(shí)，產(chǎn)酶效果最優(yōu)且菌株生物量達(dá)到最高[圖5(c)]；當(dāng)CaCl2濃度為0.6 g/l時(shí)，產(chǎn)酶效果最優(yōu)且菌株生物量達(dá)到最高[圖5(d)]。因此選擇菌株WMYB-2產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽為CaCl20.6 g/l、K2HPO40.8 g/l、MgSO41.0 g/l。

2.2.4 起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖6所示，當(dāng)初始pH值低于5.5或高于8.0時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶能力較低；當(dāng)初始pH值在6.0～7.0之間時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶量逐漸升高，在初始pH值7.5時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶量達(dá)到最高；在初始pH值為7.0時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶量次之（P＜0.05）。說明中性或者微偏堿性的環(huán)境有益于菌株產(chǎn)酶，因此選擇pH值7.5為最佳發(fā)酵初始pH值。

2.2.5 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖4 氮源種類（a）及大豆蛋白胨濃度（b）對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖5 無機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖7(a)所示，接種量為1%時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶能力較低；當(dāng)接種量提升至2%時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶能力大幅提升，此時(shí)產(chǎn)酶效果最優(yōu)，達(dá)到202.43 U/ml；當(dāng)接種量為3%時(shí)，菌株生物量達(dá)到最高，產(chǎn)酶量次之（P＞0.05）；隨后菌株生物量及產(chǎn)酶量隨接種量的升高而逐漸降低，可能是由于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的過程中，菌體濃度過高，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，產(chǎn)酶量隨之減少。菌株生物量過高反而會(huì)抑制菌株產(chǎn)酶，因此要適當(dāng)控制菌株生物量，選擇2%為最佳接種量。

圖6 起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.2.6 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖7(b)所示，裝液量為20 ml時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶能力較低；當(dāng)裝液量為40 ml時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶能力大幅提升，此時(shí)產(chǎn)酶效果最優(yōu)（P＜0.05），達(dá)到223.05 U/ml；隨后菌株生物量及產(chǎn)酶量隨裝液量的升高而逐漸降低，因此選擇40 ml/250 ml錐形瓶為搖瓶培養(yǎng)的最佳裝液量。

2.2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

菌株在28～40℃均能生長產(chǎn)酶，如圖7(c)所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于30℃時(shí)，產(chǎn)酶效果較差；隨后，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株生物量及產(chǎn)酶量逐漸升高，在培養(yǎng)溫度37℃時(shí)，菌株產(chǎn)酶效果及生物量達(dá)到最優(yōu)（P＜0.05）；當(dāng)培養(yǎng)溫度升至40℃時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶量有所降低，因此選擇37℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.2.8 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖7 培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

如圖7(d)所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在120～200 r/min之間時(shí)，菌株生物量及產(chǎn)酶量隨著搖床轉(zhuǎn)速的提升而增加；當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，菌株生物量達(dá)到最高，但產(chǎn)酶效果次之；當(dāng)轉(zhuǎn)速提升至220 r/min時(shí)，菌株產(chǎn)酶效果達(dá)到最優(yōu)（253.31 U/ml），菌株生物量次之（P＞0.05）。說明菌株WMYB-2好氧產(chǎn)酶，因此，選擇220 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.2.9 菌株96 h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶及生長動(dòng)態(tài)變化

在發(fā)酵初期，12～36 h菌體迅速生長繁殖，代謝產(chǎn)物開始大量積累，菌株生物量及產(chǎn)酶量在36 h左右達(dá)到峰值；如圖8所示，繼續(xù)延長培養(yǎng)時(shí)間，菌株生物量及產(chǎn)酶量迅速降低，96 h時(shí)的發(fā)酵效果幾乎與12 h持平（P＞0.05）。因此，選擇36 h為最佳發(fā)酵時(shí)長，此時(shí)β-甘露聚糖酶活達(dá)272.56 U/ml，約是初始酶活力的2.69倍。

2.3 產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

通過對(duì)A：魔芋微粉、B：大豆蛋白胨、C：pH值進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表4），并利用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到的二次多項(xiàng)回歸方程為：R=264.58+77.09A+27.16B+15.04C+75.12AB-27.85AC+54.49BC-47.41 A2-58.24B2-30.91C2

圖8 菌株WMYB-2的96 h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)態(tài)變化曲線

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行擬合二次模型方差分析（見表5）。方差分析得知，回歸方程的多元相關(guān)系數(shù)R2=0.832 1，校正決定系數(shù)Adj R2=0.966 9，而模型的Prob(P)＞F值為 P＜0.000 1(＜0.05 為顯著)，信噪比 Adeq Precisior=24.628，說明該回歸模型高度顯著，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)菌株WMYB-2產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)模型回歸方程系數(shù)的顯著性試驗(yàn)表明，一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB、AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2影響顯著。在實(shí)驗(yàn)所選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)產(chǎn)酶活力的影響排序?yàn)槟в笪⒎郏敬蠖沟鞍纂耍緋H值。

利用軟件對(duì)回歸方程中的交互項(xiàng)AB、AC和BC繪制響應(yīng)面分析圖和等高圖(見圖9)，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著，圓形表示兩因素交互作用微弱。

2.3.2 最佳發(fā)酵條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

通過Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)回歸方程求解，在試驗(yàn)的因素水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵的最佳條件為：魔芋微粉添加量10 g/l，大豆蛋白胨添加量10 g/l，pH值7.51。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得甘露聚糖酶酶活力為(355.75±2.06)U/ml，與理論預(yù)測(cè)值352.36 U/ml的相對(duì)誤差較小，說明該回歸方程對(duì)菌株WMYB-2發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的分析和預(yù)測(cè)是可信的。

表5 回歸方程各項(xiàng)方差分析

2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 溫度對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響

菌株WMYB-2產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在45～55℃時(shí)酶活相對(duì)穩(wěn)定[圖10(a)]，55℃保溫30 min后其相對(duì)酶活力仍余92%，保溫2 h后相對(duì)酶活力余68%；60℃保溫2 h后相對(duì)酶活力僅余 55%[見圖 10(b)]。

2.4.2 pH值對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響

圖9 兩因素交互作用對(duì)菌株WMYB-2產(chǎn)酶活力影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖10 溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活力（a）及穩(wěn)定性（b）的影響

菌株WMYB-2產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值5.0～9.0內(nèi)較穩(wěn)定，在pH值為10.0時(shí)，仍能保持54%的相對(duì)酶活力[見圖11(a)]。該酶具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍，且在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性良好，在pH值5.0～10.0處理2 h后酶活力余80%以上；在pH值為9.0的環(huán)境下處理2 h后，仍能保持95%的相對(duì)酶活力[見圖11(b)]。

2.4.3 金屬離子及其他化合物對(duì)酶活力的影響

圖11 pH值對(duì)β-甘露聚糖酶活力（a）及穩(wěn)定性（b）的影響

Li+和 K+對(duì)該酶具有較強(qiáng)的激活作用，Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+對(duì)該酶酶活力的抑制效果不明顯；Cu2+和SDS對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，Zn2+和EDTA對(duì)該酶具有較強(qiáng)的抑制作用（見圖12）。

圖12 金屬離子、EDTA及SDS對(duì)β-甘露聚糖酶活力的影響

3 結(jié)論

本研究以透明圈法初篩、DNS法測(cè)β-甘露聚糖酶活力、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從土壤中篩選分離得到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶活力較高的野生型菌株。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)枯草芽孢桿菌WMYB-2搖瓶發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了合理可靠的二次多項(xiàng)模型，模型與相關(guān)數(shù)據(jù)擬合度較高。菌株WMYB-2產(chǎn)β-甘露聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為：魔芋微粉 10.0 g/l、大豆蛋白胨 10.0 g/l、CaCl20.6 g/l、K2HPO40.8 g/l、MgSO4·7H2O 1.0 g/l，pH值7.51，接種量2%，裝液量40 ml/250 ml三角瓶，37 ℃、220 r/min，在此條件下發(fā)酵36 h，酶活力達(dá)到355.75 U/ml。較之前報(bào)道的枯草芽孢桿菌所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力高[8-9，13-16]。

菌株WMYB-2所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在45～55℃幾乎不損失酶活力，55℃保溫30 min仍保留92%的相對(duì)酶活力，保溫3 h后相對(duì)酶活力仍余57%，該酶的最適pH值為5.5，在pH值5.0～10.0內(nèi)有較高的酶活力和穩(wěn)定性，處理2 h酶活力仍能保留80%以上，其酸堿穩(wěn)定性較之前報(bào)道的β-甘露聚糖酶更寬泛[17-20]。該酶在pH值9.0和10.0的條件下處理2 h后其相對(duì)酶活力仍分別保留95%和81%，較已報(bào)道的同類菌株產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的pH值穩(wěn)定性更好[16，20-22]。該酶還具有較好的金屬離子及化學(xué)試劑抗性，Li+和K+對(duì)其具有一定的激活作用，Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+對(duì)其酶活力的抑制效果不明顯。該酶較好的熱穩(wěn)定性及良好的酸堿穩(wěn)定特性，使其具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。