■王乙茹 柳成東 白華毅 李亞平 袁明鳳 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201；2.昆明三正生物科技(集團)有限公司，云南昆明650201；3.云南快大多畜牧科技有限公司，云南玉溪653100）

全球熱帶地區(qū)以及季節(jié)性高溫區(qū)域的熱應激問題已經(jīng)給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來較大損失（Pawar等，2016），在我國夏季的廣大地區(qū)也普遍存在，尤其是廣東、海南、云南南部等地區(qū)（李葉涵等，2016；吳琦琳,2018）。歐美等畜牧業(yè)發(fā)達地區(qū)采用先進的控溫設施化養(yǎng)殖方式，雖能解決肉雞熱應激問題，但顯然高養(yǎng)殖成本限制了普遍性的推廣（Sugiharto等，2017；朱艷伶等，2018）。因此，全球家禽營養(yǎng)學家及養(yǎng)殖企業(yè)更期望通過營養(yǎng)措施改善肉雞熱應激難題，盡可能減少養(yǎng)殖經(jīng)濟損失，因為這更具普遍性與推廣價值（Wang等，2018；覃子榕，2018）。

大量研究顯示（Attia等，2017；Mohammed等，2018；Wang等，2018；張春壘等，2018），飼用益生菌通過維持腸道正常形態(tài)與菌群平衡，改善飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化利用，從而顯著提高非熱應激肉雞的生產(chǎn)性能。然而，在熱應激條件下，日糧添加益生菌對肉雞生產(chǎn)性能影響的試驗報道十分有限，且這些報道主要為復合飼用益生菌的研究。目前，針對單一菌株的試驗研究只有乳酸桿菌（Jahromi等，2016）和枯草芽孢桿菌（Al-Fataftah等，2014；Wang等，2018）的3篇報道。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)是芽孢桿菌屬乳酸菌，具備乳酸桿菌產(chǎn)酸抑菌與枯草芽孢桿菌耐熱適合飼料制粒的共同優(yōu)勢，倍受當前飼料與養(yǎng)殖企業(yè)的關(guān)注（程志斌等，2018；王乙茹等，2018；楊保和等，2018）。雖然，凝結(jié)芽孢桿菌2013年已經(jīng)列入我國《飼料添加劑品種目錄》，可在肉雞飼料與養(yǎng)殖中使用（夏濤等，2018）。然而，迄今為止凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激肉雞的作用效果尚無科學報道。鑒于此，本文初步探討飼糧單一添加凝結(jié)芽孢桿菌對22～42日齡持續(xù)熱應激AA肉雞的生產(chǎn)性能影響，以期拓展凝結(jié)芽孢桿菌在肉雞實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517

課題組從云南省西雙版納州景洪市熱區(qū)農(nóng)村的散養(yǎng)茶花雞腸道中，分離出一株產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌，該菌株經(jīng)過課題組系統(tǒng)的理化分析與16sRNA鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，命名凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517，并用于本次動物試驗。

1.2 試驗動物與試驗設計

將21日齡健康AA肉公雞240只，按照體重一致原則，分成3個處理組（見表1）。每個處理組10個重復，每個重復8只雞飼養(yǎng)在同一個試驗籠中。對照組為常溫[（22±1）℃]處理組，試驗組1和試驗組2為持續(xù)熱應激[（33±1）℃，24 h/d]處理組，其中：試驗組1不添加凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517，試驗組2添加凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517，其添加量為4×106CFU/g（全價配合飼料），這一添加量參考Wu等（2018）的試驗報道。

表1 試驗設計

1.3 試驗日糧

試驗飼糧營養(yǎng)水平參考《雞飼養(yǎng)標準（NY/T 33—2004）》配制，具體見表2。為了排除飼料原料因素的干擾，試驗飼糧選用“玉米-豆粕”型日糧，所有處理組試驗飼料不添加任何飼用抗生素及化學合成抑菌藥物。試驗飼糧80℃制成顆粒使用。

表2 試驗基礎日糧配方及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

本試驗在云南農(nóng)業(yè)大學試驗雞場進行，為了保證環(huán)境溫度的可控性，試驗選用了2間并排的雛雞脫溫室，并更換了大雞籠用于飼養(yǎng)試驗。對照組肉雞的脫溫室控制溫度（22±1）℃，試驗組1和試驗組2肉雞的脫溫室控制溫度（33±1）℃。試驗周期22～42日齡階段，共21 d。

試驗全期采用籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)，24 h光照，自由采食和飲水，執(zhí)行正常的免疫程序。由于所有處理組日糧沒有添加任何飼用抗生素及化學合成抑菌藥物，試驗強化了日常管理、清糞與消毒，保證良好的雞舍環(huán)境，實時了解雞群狀況，及時治療。

1.5 測定指標

1.5.1 生長性能

測定試驗雞體重、采食量數(shù)據(jù)，并計算平均日增重、平均日采食量、飼料轉(zhuǎn)化效率（飼料/增重比）等指標。

肉雞腹瀉造成糞便敷住肛門，以每個處理組為單位，觀察并統(tǒng)計每個處理組“敷肛”腹瀉率，同時觀察肉雞死亡率，并及時處理。

1.5.2 飼料營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率

飼料營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率測定方法參考孫蘇皖等（2018）的報道，簡述如下：試驗第18 d（39日齡）時，以每個重復為單位，采用全收糞法進行代謝試驗，試驗期4 d。每天定時給料，自由飲水，定時收集試驗雞的排泄物，并清理排泄物上的羽毛、皮屑和撒落的飼料，對清理出來的飼料進行計量，并準確計算每天的采食量。將排泄物無損失地全部轉(zhuǎn)入已知重量的鋁盒中，稱重并加入10%鹽酸（按100 g鮮糞樣加10 ml的比例），隨后將其保存于4℃冰箱中。糞樣收集結(jié)束后，將每個處理組4 d收集的糞樣混合，在105℃烘箱中干燥1 h，之后將烘箱溫度調(diào)至65℃，直至烘干。隨后室溫下回潮24 h之后稱重并記錄。干燥糞樣粉碎，過40目篩，制成風干樣，密封待測。糞樣以及取的試驗飼料樣測定常規(guī)營養(yǎng)成分，包括：粗水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量。最終，計算出試驗雞對飼糧干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的表觀代謝率。

1.5.3 血清生化指標測定

試驗結(jié)束的42日齡肉雞，每個重復中挑選1只肉雞進行翅下采血，每只采血5 ml，制備血清，分裝后-20℃保存待測以下指標（許運岑等，2017）。

血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖等指標，采用全自動生化分析儀測定（全自動生化分析儀DIRUI CS-4008，長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，長春市）。血清中皮質(zhì)酮含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和天門谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，使用酶標儀（Bio-tek ELX-808IU，美國）測定，試劑盒從南京建成生物科技有限公司購買，并按照說明書操作測定。以上所有指標分析在云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院完成。

1.6 統(tǒng)計分析

測定結(jié)果用“平均值（Mean）±標準差（STDEV）”表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，對處理組間進行單因素多重比較統(tǒng)計，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞血清皮質(zhì)酮濃度的影響（見圖1）

圖1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞血清皮質(zhì)酮濃度的影響

對照組、試驗組1和試驗組2肉雞42日齡血清皮質(zhì)酮的濃度分別為(674.7±48.8)、(967.4±98.6)、(806.2±72.2)pg/ml。與對照組肉雞血清皮質(zhì)酮濃度相比，試驗組1升高了43.4%，差異顯著（P＜0.05）；試驗組2升高了19.5%，但差異不顯著（P＞0.05）。試驗組2肉雞血清皮質(zhì)酮濃度比試驗組1降低了16.7%，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞生長性能的影響（見表3）

肉雞末體重、平均日增重、平均日采食量等3個指標，試驗組1和試驗組2差異不顯著（P＞0.05），且顯著低于對照組（P＜0.05）。料重比指標，試驗組1和試驗組2統(tǒng)計差異不顯著（P＞0.05），且顯著高于對照組（P＜0.05）。對照組和試驗組2肉雞腹瀉率數(shù)據(jù)相同，且低于試驗組1。試驗全期各處理組肉雞無死亡。

表3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞生長性能的影響

2.3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞飼料營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率的影響（見表4）

干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等4個指標，三個處理組之間差異均不顯著（P＞0.05）。對照組肉雞對飼料粗脂肪的表觀代謝率有低于試驗組1和試驗組2的趨勢（0.05＜P＜0.1）。

表4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞飼料營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率的影響(%)

2.4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞血清生化指標的影響（見表5）

與對照組肉雞血清膽固醇濃度相比，試驗組1顯著高于對照組（P＜0.05），試驗組2與對照組差異不顯著（P＞0.05）。試驗組1和試驗組2肉雞血清膽固醇濃度差異不顯著（P＞0.05）。低密度脂蛋白膽固醇濃度指標，對照組最低、試驗1組最高，且3個處理組之間差異均顯著（P＜0.05）。此外，其他血液生化指標，3個處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

現(xiàn)有試驗研究與文獻綜述證明：熱應激的方式（持續(xù)熱應激或間歇性熱應激）、熱應激的溫度與濕度等因素，對肉雞生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)代謝利用、血液生化指標及激素水平等產(chǎn)生了綜合的負面影響（Sohai等，2012；Song等，2014；Jahromi等，2016；Wang等，2018）。為了初步探討飼用凝結(jié)芽孢桿菌對AA肉雞生產(chǎn)性能的影響，本試驗使用課題組篩選鑒定的一株凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517，并在昆明云南農(nóng)業(yè)大學試驗雞場的雛雞脫溫室，模擬云南省西雙版納、德宏等熱區(qū)環(huán)境[全天持續(xù)熱應激條件(33±1)℃]開展試驗。凝結(jié)芽孢桿菌在AA肉雞試驗飼糧中的添加量4×106CFU/g（全價配合飼料），依據(jù)最新Wu等（2018）的報道。

表5 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激AA肉雞血清生化指標的影響

血清皮質(zhì)酮濃度是表征畜禽應激的最重要指標之一（Lara等，2013；Pawar等，2016），一般而言皮質(zhì)酮濃度與生產(chǎn)性能呈顯著的負相關(guān)（Nelson等，2018；Selvam等，2018）。大量試驗研究顯示（Sohail等，2010；Sohail等，2012；Najafi等，2015；楊梅梅，2016；Rajaei-Sharifabadi等，2017；Selvam等，2018）：肉雞在32～38℃環(huán)境持續(xù)性或間歇性熱應激條件下，血清皮質(zhì)酮水平明顯上升。圖1本試驗結(jié)果顯示，與正常溫度飼養(yǎng)的對照組肉雞相比，持續(xù)33℃高溫的試驗組1肉雞血清皮質(zhì)酮濃度急劇升高了約43.4%（P＜0.05），說明該試驗條件下肉雞養(yǎng)殖熱應激反應十分明顯。這一結(jié)果與楊梅梅（2016）和Rajaei-Sharifabadi等（2017）結(jié)果基本一致。在試驗組1熱應激條件下添加飼用凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517的試驗組2肉雞，其血清皮質(zhì)酮濃度比試驗組1顯著降低了16.7%（P＜0.05），且與正常溫度的對照組肉雞差異不顯著（P＞0.05）。以上試驗結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)：日糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對降低AA肉雞血液皮質(zhì)酮濃度、緩解肉雞熱應激反應，有積極的正面作用，這十分有利于改善熱應激肉雞的生產(chǎn)性能。然而，凝結(jié)芽孢桿菌降低熱應激肉雞血清皮質(zhì)酮水平的作用機理，目前沒有相關(guān)報道，這有待于進一步試驗研究。

本試驗條件下，對照組、試驗組1和試驗組2肉雞22～42日齡的平均采食量分別為149.9 g、131.4 g、129.7 g。與對照組相比，很明顯試驗組1熱應激肉雞采食量顯著降低約12.3%（P＜0.05）。已有的多篇試驗報道顯示（Sohail等，2012；洪奇華等，2014；楊梅梅,2016；李秋粉,2017）：與非熱應激肉雞相比，熱應激條件下肉雞采食量顯著降低8.0%～17.8%。熱應激條件下添加凝結(jié)芽孢桿菌的試驗組2肉雞采食量與試驗組1幾乎相似，仍然顯著低于非熱應激的對照組肉雞，這一結(jié)果說明：單一添加飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌，不能扭轉(zhuǎn)熱應激肉雞采食量的顯著下降。當前有限的3篇試驗報道也顯示：單一添加飼用枯草芽孢桿菌（Al-Fataftah等，2014；Wang等，2018）或單一添加飼用乳酸桿菌（Jahromi等，2016）也不能明顯提高熱應激肉雞的采食量。由于采食量無法得以改善，這直接造成試驗組1和試驗組2肉雞平均日增重顯著低于對照組（表3）。

然而，試驗組2肉雞料重比1.91，比試驗組1肉雞的料重比下降了約3%。盡管這一數(shù)據(jù)統(tǒng)計差異不顯著（P＞0.05），但已經(jīng)顯示了飼用凝結(jié)芽孢桿菌對熱應激肉雞飼料轉(zhuǎn)化效率改善的積極作用。由于本次試驗飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌4×106CFU/g（全價配合飼料）依據(jù)的是Wu等（2018）在非熱應激AA肉雞上的有效添加量。因此，我們推測：如果進一步提高熱應激肉雞飼糧中凝結(jié)芽孢桿菌的使用量，試驗組2熱應激肉雞飼料轉(zhuǎn)化效率的改善幅度進一步提高，是可以預期的。這一推測有待于下一步試驗證明。理論上如果按照商品肉雞飼料平均價格3 000元/t、飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品成本70元/kg估算，熱應激條件下可節(jié)約肉雞飼料成本52元/t，或養(yǎng)殖成本0.12元/只肉雞。據(jù)此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌已經(jīng)顯示了在熱應激肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中節(jié)約飼糧與養(yǎng)殖成本的突出實際效果。

非熱應激對照組肉雞的飼料干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分表觀代謝率分別為74.32%、70.10%、56.53%、35.30%，這與張浩等（2016）報道正常養(yǎng)殖肉雞的飼料表觀代謝率結(jié)果基本相似。表4結(jié)果顯示：雖然飼料干物質(zhì)、粗蛋白、粗灰分等表觀代謝率指標，三個處理組之間統(tǒng)計差異均不顯著（P＞0.05），但測定數(shù)據(jù)均體現(xiàn)對照組數(shù)值最高、試驗組2次之、試驗組1最低，以上結(jié)果與表1生長性能的數(shù)據(jù)基本吻合。Attia等（2017）在15～42日齡科寶（Cobb-500）肉雞上，采用間歇式熱應激試驗模型（36℃,7 h/d），研究了復合飼用益生菌對肉雞飼料干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率的影響，結(jié)果顯示：與非熱應激肉雞相比，熱應激肉雞無論是否使用復合飼用益生菌，其均對飼料干物質(zhì)、粗蛋白、粗灰分的表觀代謝率均無顯著影響。Attia等（2017）的報道與表4結(jié)果基本一致。

表4可見，熱應激試驗組1肉雞的粗脂肪表觀代謝率比對照組增加了約6.5%，雖然統(tǒng)計差異不顯著（P＞0.05），但有差異的趨勢（0.05＜P＜0.1）。不僅如此，表5進一步發(fā)現(xiàn)熱應激試驗組1肉雞血液的甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，分別比對照組增加了 10.0%（P＞0.05）、24.1%（P＜0.05）、85.2%（P＜0.05）。以上結(jié)果提示：與非熱應激的正常養(yǎng)殖條件相比，熱應激具有增加肉雞對飼糧脂肪能量需求的趨勢。這可能與熱應激肉雞皮質(zhì)酮水平升高，而造成正常生理的肉雞能量消耗增大（Xie等，2015）或可能的亞健康、免疫反應額外消耗機體能量（Quinteiro-Filho等，2012;Alhenakya等，2017）直接相關(guān)，也是熱應激養(yǎng)殖條件下往往提高肉雞飼糧配方能量水平的關(guān)鍵原因之一（Quinteiro-Filho等，2012;Alhenakya等，2017）。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，相較于未使用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗組1熱應激肉雞，飼糧使用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗組2熱應激肉雞的血液甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，均有下降的態(tài)勢，且膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇下降水平達到顯著水平（P＜0.05）。以上結(jié)果也與圖1所示試驗組2肉雞皮質(zhì)酮水平，較試驗組1有顯著下降，基本相符。此外，血液總蛋白、白蛋白、葡萄糖等指標，三個處理組之間統(tǒng)計差異也不顯著（P＞0.05），這與楊梅梅（2016）報道復合飼用益生菌對熱應激肉雞血液生化指標影響的結(jié)果基本一致。

4 小結(jié)

在本試驗22～42日齡階段采用的(33±1)℃持續(xù)高溫條件下，與非熱應激AA肉雞相比，熱應激肉雞的血清皮質(zhì)酮水平上升明顯，直接導致熱應激肉雞的平均日采食量、平均日增重、料重比等生產(chǎn)性能指標顯著下降。同時，肉雞飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517，有效降低了熱應激肉雞的血清皮質(zhì)酮水平，直接效果是對飼料/增重比顯示了改善的積極作用。

本次試驗也提示：應對肉雞實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中客觀存在的熱應激，當養(yǎng)殖企業(yè)無法進一步改善雞舍環(huán)境溫度（熱應激溫度、持續(xù)時間與飼養(yǎng)管理水平）的情況下，添加優(yōu)質(zhì)的飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品，雖然無法扭轉(zhuǎn)熱應激肉雞采食量與生長速度的下降，但可以通過提高飼料轉(zhuǎn)化效率，一定程度上減少肉雞養(yǎng)殖的實際經(jīng)濟損失與風險。