李紅，劉國麗，劉巖巖，張敏

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161）

黑木耳（Auricularia auricula-judae（bull.）Quel.）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌亞綱（Agaricomycetes），木耳目（Auriculariales），木耳科（Auriculariaceae），木耳屬（Auricularia），具有非常重要的食藥用價值。中國是世界上黑木耳生產(chǎn)大國[1]，遼寧省是僅次于黑龍江省和吉林省的黑木耳生產(chǎn)大省，種植總量已接近1億袋，干品年產(chǎn)量5 300 t，產(chǎn)值近3億元，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收方面發(fā)揮了重要作用。近年來由于菌種選育工作滯后，黑木耳雜交種較少，絕大多數(shù)是由野生種馴化而來，且缺乏不同季節(jié)、不同栽培方式、不同地區(qū)的生產(chǎn)專用型品種，嚴(yán)重影響該產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此對黑木耳高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選和選育工作勢在必行[2]。該試驗選取黑木耳2個主栽品種為親本，采用單孢雜交方式，使兩親本優(yōu)勢互補，旨在篩選出適合遼寧地區(qū)氣候條件下高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強的優(yōu)良黑木耳新品種，為黑木耳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雜交親本。黑29和黑山菌株均為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所的保存菌種（表1）。

1.1.2 培養(yǎng)基。①PDA綜合培養(yǎng)基配方，土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，蛋白胨0.3%，水1 000 mL，pH自然。用于單孢子分離、單孢子培養(yǎng)、單核菌絲配對等室內(nèi)試驗；②栽培基質(zhì)配方，木屑85.5%、麩皮10%、豆餅粉2%、石膏1%、石灰1.2%、磷酸二氫鉀0.3%，含水量60%，用于制作二級種及出菇試驗。

表1 親本特征特性

1.2 方法

1.2.1 單孢子收集與分離。選七八分熟、耳型好、無病蟲害的親本子實體，去根，表面用75%酒精消毒。在超凈工作臺下，分別掛于滅過菌的三角瓶中，用滅過菌的牛皮紙封口，靜置培養(yǎng)15～17 h，用無菌水稀釋，即成孢子液原液，放置4℃冰箱中保存待用。在無菌的條件下，用10 mL的注射器在超凈工作臺上將孢子原液分別稀釋成10-1、10-2、10-3等濃度，在顯微鏡下觀察每滴孢子液中所含孢子的數(shù)量，當(dāng)每滴孢子液中含有2～3個孢子時為最佳接種液，用移液槍吸取最佳接種液0.5 mL，均勻涂于平板PDA培養(yǎng)基中，在23℃恒溫箱中倒置避光培養(yǎng)8～10 d，待孢子萌發(fā)[4]。

1.2.2 單核菌絲檢查。新菌落萌發(fā)至直徑為2～3 cm時，鏡檢單孢子萌發(fā)的菌絲，觀察有無鎖狀聯(lián)合。將無鎖狀聯(lián)合的單核菌絲轉(zhuǎn)接到斜面PDA培養(yǎng)基上，23℃下培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)基后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單孢雜交。黑29菌株和黑山菌株的單核菌絲接種在同一平板PDA培養(yǎng)基上，接種點相距3 cm，23℃下培養(yǎng)8～12 d，鏡檢單核菌絲結(jié)合處，如發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，說明雜交配對成功。

1.2.4 雜交菌株鑒定。①拮抗試驗，采用三點接種法，分別把親本菌株及雜交菌株接種在平板PDA培養(yǎng)基上，每兩點間距2 cm，接種后在23℃下恒溫箱培養(yǎng)，觀察雜交菌株與親本之間有無拮抗線；②酯酶同工酶電泳試驗，取親本及雜交菌株菌絲體，加入酶提取液在冰浴中研磨后，離心取上清液備用，采用聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，將電泳后的凝膠浸入染色液中，觀察雜交菌株與親本菌株的酯酶同工酶電泳圖譜。

1.2.5 菌絲生長速度測定。將各雜交菌株和親本菌株接種在平板PDA培養(yǎng)基上，23℃下黑暗培養(yǎng)，觀察菌絲生長勢及色澤。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速度。

菌絲生長速度＝培養(yǎng)皿直徑/培養(yǎng)總時間。

1.2.6 栽培對比試驗。采用17 cm×35 cm×0.04 cm聚丙烯塑料袋，根據(jù)栽培基質(zhì)配方，每袋裝干料250 g，雜交菌株和親本菌株各接種300袋，按露地全光標(biāo)準(zhǔn)栽培模式管理，定時扎眼、催芽，觀察記錄菌絲長勢、污染袋數(shù)、出芽到耳片分化的時間、子實體生長狀況等。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢收集與分離

將黑29和黑山2個親本菌株進行孢子收集、稀釋分離及培養(yǎng)，鏡檢鑒定親本菌株黑29的孢子單核體35個，黑山的孢子單核體20個，單核體菌絲與雙核菌絲相比，菌絲纖細(xì)，不具有鎖狀聯(lián)合（圖1），菌落較疏松（圖2），不一致，不均勻，絨毛狀，菌絲生長速度一般比雙核菌絲長速慢。

2.2 雜交菌株配對

從親本單核體材料中各隨機挑取10個單核體材料進行兩兩配對雜交，挑取兩菌落交接處菌絲體進行鏡檢，雙核菌絲（圖3）且無成功配對的（圖4）有鎖狀聯(lián)合的30個菌株初步確定為雜交菌株（圖5）。

2.3 雜交菌株鑒定

2.3.1 拮抗試驗。將配對成功的30個雜交菌株與兩親本進行拮抗試驗，結(jié)果表明，有17個雜交菌株與親本存在明顯的拮抗反應(yīng)（圖6），將這些雜交菌株依次編號為D1～D17，轉(zhuǎn)管備用。

圖1 單核體菌絲

圖2 單核體菌落

圖3 雙核體菌絲（×400）

圖4 未成功配對

圖5 成功配對

圖6 部分雜交菌株與親本菌株的拮抗反應(yīng)

圖7 雜交菌株與親本菌株間酯酶同工酶酶譜

2.3.2 酯酶同工酶電泳試驗。從圖7可以看出，19個菌株共檢測 101條譜帶，得到11個酶譜類型，Rf 0.196～0.761，其中 Rf2=0.359、Rf7=0.587、Rf9=0.652為所有菌株共有的3條基礎(chǔ)酶帶，但酶帶寬窄、濃淡略有不同。D1與親本1，D6、D9、D10與親本2譜帶基本相同，但是其他雜交菌株與2個親本都有很大差異，Rf1、Rf4、Rf6、Rf8、Rf10均為雜交菌株的特異性酶帶。說明雜交菌株既與親本之間有同源性，又有屬于自己的特征酶帶，是有別于親本的新菌株。在凝膠的某個相同的遷移率位置上有條帶的記為1，無條帶的記為0，利用DPS數(shù)值處理系統(tǒng)軟件中的UPGMA計算19個黑木耳菌株酶譜之間的聯(lián)合系數(shù)，并對所得的酶帶進行系統(tǒng)聚類分析。從圖8可以看出，在相異水平60%左右時，可以把19個菌株分為5類，第一類包括親本 1、親本 2、D1、D2、D5、D6、D9、D10、D12、D13、D14、D15、D17 等 13 個菌株；第二類包括D7 1個菌株；第三類包括D3、D8 2個菌株；第四類包括D11、D16 2個菌株；第五類包括D4 1個菌株。

圖8 聚類分析圖

2.4 菌絲生長速度測定

從表2可以看出，雜交菌株經(jīng)鑒定，選擇具有拮抗并且遺傳差異與親本較大的11個雜交菌株進行菌絲生長速度測定。雜交菌株 D4、D8、D11、D12、D14菌落顏色濃白，邊緣整齊或較整齊，菌絲生長速度大于親本2，可以初步判定為優(yōu)良菌株，進行下一步出菇試驗。其他雜交菌株菌落顏色灰白，邊緣不整齊，菌絲生長速度慢，小于親本菌株，應(yīng)予淘汰。

2.5 栽培對比試驗

栽培性狀是鑒別食用菌品種優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，對不同黑木耳品種進行栽培對比試驗，是篩選最優(yōu)品種的有效方法。栽培對比試驗結(jié)果見表3，雜交菌株D4、D12、D14子實體形體與親本1相似，D4現(xiàn)耳時間早，出耳整齊度一般，抗性一般，產(chǎn)量最高，但是沒有超過親本1，D12和D14現(xiàn)耳時間較早，出耳整齊度低，抗性較差，產(chǎn)量低；雜交菌株D8、D11子實體形態(tài)與親本2相似，D8與D11比較來看，現(xiàn)耳時間較早，出耳整齊度高，抗性強，產(chǎn)量超過親本2，達到40 g/袋，D11則次之。單從產(chǎn)量上看，D4高于D8，但是從子實體形態(tài)上看，少筋品種比多筋商品性強，價錢高，所以D8比D4較有優(yōu)勢，可作為一個優(yōu)良的雜交菌株進行儲備，具有開發(fā)成為新品種的潛力（圖 9）。

表2 菌絲生長速度及生長勢

表3 不同黑木耳菌株子實體生長情況及產(chǎn)量

圖9黑木耳不同雜交菌株的子實體形態(tài)

3 結(jié)論與討論

單孢雜交是利用子實體里的單孢，將不同基因、遠(yuǎn)源的親本互相交配，把產(chǎn)生了鎖狀聯(lián)合的雙核體單獨的進行生產(chǎn)試驗和產(chǎn)量的驗證，從中可以找到所需的優(yōu)良配對組合。單孢雜交是食用菌育種工作中最常用的方法，雜交過程隨機性強，工作量較大但效率不一定高，雜交菌株的優(yōu)劣必須通過栽培試驗才能確定[5-6]。多次試驗證明雖然單孢雜交育種效率不高，但具有選育優(yōu)良雜交菌株的潛力，不過需要育種工作者大量的雜交篩選工作及多年栽培試驗。

雜交菌株的鑒定是黑木耳雜交育種的重要工作。該試驗從以下幾個方面對黑木耳雜交菌株進行規(guī)范性鑒別：一是觀察雜交菌株是否存在鎖狀聯(lián)合；二是進行與親本間是否存在拮抗現(xiàn)象的試驗；三是進行酯酶同工酶試驗，觀察雜種與親本的親緣關(guān)系；四是進行出菇試驗，觀察雜種能否結(jié)實及子實體的生長狀況。這些鑒別指標(biāo)是目前食用菌育種專家的共識[7-8]。雜交菌株D8商品性強，產(chǎn)量比親本有明顯優(yōu)勢，但是尚需進行連續(xù)跟蹤試驗，確定其豐產(chǎn)性和穩(wěn)定性，摸清其配套的栽培技術(shù)和菌株生物學(xué)特性，并申請國家新品種審（認(rèn)）定。