何 丹，王 蘋，李亞純，尹萬(wàn)忠

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

miRNA是真核生物中一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA，能通過(guò)與靶特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控[1,2]。miRNAs與腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)[3]，miRNA表達(dá)的改變可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。miRNA在腫瘤的多藥耐藥中與其作用的靶基因組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控腫瘤的多藥耐藥性。本實(shí)驗(yàn)擬研究miRNA210及其靶基因在喉癌多藥耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，miArrestTMmiRNA210 inhibitor Expression Clone慢病毒表達(dá)載體購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司。雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。合成質(zhì)粒HTRA1、NUPR1購(gòu)自上海捷瑞公司。CCK8試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體驗(yàn)證miRNA210的靶基因 合成我們前期研究中預(yù)測(cè)的miRNA210靶基因HTRA1、NUPR1 3’UTR序列，篩選并購(gòu)買雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO，轉(zhuǎn)化、小量搖菌、小提質(zhì)粒，將質(zhì)粒郵寄上海捷瑞公司，將3’UTR序列插入到pmirGLO中。合成質(zhì)粒HTRA1、NUPR1。購(gòu)買miR210表達(dá)載體、 miR210抑制物載體，及相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，質(zhì)粒提純并備用。報(bào)告基因質(zhì)粒HTRA1、NUPR1與miR210表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞裂解液并用于熒光素酶檢測(cè)，應(yīng)用PROMEGA雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲及海腎熒光素酶活性。將NUPR1載體做定點(diǎn)突變，測(cè)序，比較突變后miRNA210能否抑制其表達(dá)。

1.2.2miRNA210抑制物質(zhì)粒對(duì)喉癌多藥耐藥表型的改變 復(fù)蘇耐藥細(xì)胞Hep-2v。每50毫升含血清DMEM加入360 μl VCR儲(chǔ)存液(100 μM),miR210抑制物質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2v。CCK8 實(shí)驗(yàn):Hep-2v細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分2組，轉(zhuǎn)染Control質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染miR-210抑制物質(zhì)粒組，每組設(shè)5復(fù)孔。在轉(zhuǎn)染后24 h點(diǎn)終止培養(yǎng)，每孔加入10 μl CCK8溶液，37℃下孵育1-4小時(shí)，測(cè)定450 nm處的OD值。細(xì)胞活力為處理組的OD值/正常組OD值×100%。

1.2.3轉(zhuǎn)染miRNA210抑制物質(zhì)粒后多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為三組，Hep-2v組，轉(zhuǎn)染對(duì)照組Control/Hep-2v組，轉(zhuǎn)染miRNA-210抑制物質(zhì)粒組miR210in/Hep-2v組。Real-time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染抑制物前后MDR1、NUPR1基因的表達(dá)。以人Actin為內(nèi)參，PCR反應(yīng)的特異性通過(guò)產(chǎn)物熔解曲線進(jìn)行確認(rèn)，mRNA的相對(duì)含量根據(jù)公式Fold change =2-ΔΔCT計(jì)算。CT為反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

1.2.4轉(zhuǎn)染miRNA210抑制物質(zhì)粒后多藥耐藥相關(guān)基因蛋白的表達(dá) 免疫熒光染色：細(xì)胞培養(yǎng)并收取樣本，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2次，加入4%的多聚甲醛溶液固定30 min，用0.1 mol/L PBS洗滌3次，加入1% Triton X-100處理15 min，5%羊血清封閉1 h，加入一抗( Rabbit anti-Nupr1 ，1∶100稀釋，Rabbit anti-MDR1，1∶100稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，用0.1 mol/L的PBS洗滌3×15 min，加入二抗(Alexa Fluor 555羊抗兔IgG，1∶400，Alexa Fluor 488羊抗兔IgG)，室溫避光放置1 h，0.1 mol/L的PBS洗滌，加入Hoechest33342標(biāo)記細(xì)胞核，甘油封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS Statistics 10.0軟件進(jìn)行分析,生長(zhǎng)抑制的比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1miRNA210靶基因的驗(yàn)證

構(gòu)建3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒HTRA1、NUPR1分別與miRNA210表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因/內(nèi)參基因的熒光比值確定miRNA210的作用靶點(diǎn)。結(jié)果見圖1。HTRA1的熒光值在miRNA210組和Control質(zhì)粒組之間無(wú)明顯差別。而NUPR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的熒光值明顯低于轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒組。表明NUPR1基因可能是miRNA210的靶點(diǎn)。構(gòu)建一個(gè)NUPR1 3′UTR的miRNA210靶點(diǎn)的突變質(zhì)粒，與miRNA210共轉(zhuǎn)染，結(jié)果見圖2，野生型(WT)的NUPR1組的熒光值明顯低于突變組(MU)。進(jìn)一步證實(shí)，NUPR1是miRNA210的作用靶點(diǎn)。

2.2抑制miRNA210表達(dá)對(duì)喉癌多藥耐藥表型的改變

轉(zhuǎn)染Control質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染miRNA210抑制物質(zhì)粒組(miR210in)通過(guò) CCK8 實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染miRNA210抑制物質(zhì)粒組，Hep-2v細(xì)胞的存活率明顯降低。見圖3。

圖1 比較NUPR1和HTRA1質(zhì)粒與miRNA210共表達(dá)的熒光值變化 圖2 比較野生型NUPR1和突變性NUPR1質(zhì)粒與miRNA210共表達(dá)的熒光值變化 圖3 miRNA210抑制物質(zhì)粒組對(duì)Hep-2v細(xì)胞的抑制作用miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

2.3抑制miRNA210表達(dá)對(duì)喉癌多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)的改變

轉(zhuǎn)染miRNA210抑制物質(zhì)粒組miR210in/Hep-2v組中NUPR1mRNA的表達(dá)明顯增高3.11倍，P<0.01,而MDR1mRNA的表達(dá)明顯降低2.05倍,P<0.01。表明抑制miRNA210的表達(dá)則喉癌耐藥細(xì)胞多藥耐藥基因的表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)。見圖4及圖5。

2.4抑制miRNA210表達(dá)對(duì)喉癌多藥耐藥相關(guān)基因蛋白表達(dá)的改變

P<0.01,miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

P<0.01，miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

Hep-2v細(xì)胞NUPR1蛋白(P8)表達(dá)位于細(xì)胞膜，少量位于細(xì)胞漿中，呈綠色熒光染色，miRNA210in/Hep-2v細(xì)胞組中NUPR1蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯增加；而MDR1蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯下降。見圖6及圖7。

圖6 miRNA210in轉(zhuǎn)染Hep-2v細(xì)胞NUPR1蛋白表達(dá)

圖7 miRNA210in轉(zhuǎn)染Hep-2v 細(xì)胞MDR1蛋白表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室分別開發(fā)出了應(yīng)用于預(yù)測(cè)miRNA靶基因的計(jì)算機(jī)方法，這些方法依據(jù)miRNA與靶基因3′UTR的序列互補(bǔ)性，包括miRNA5′端的稱之為“seed”或“nucleus”的串聯(lián)堿基的存在和該位點(diǎn)的物種間保守性，并計(jì)算了預(yù)測(cè)的miRNA：mRNA雙鏈的自由能。但是這種預(yù)測(cè)方法并不能完全確定miRNA的靶基因，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，而實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因常用的是構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體。在這個(gè)載體的報(bào)告基因編碼區(qū)的下游含有靶基因的3′UTR區(qū)和推測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)，用該載體轉(zhuǎn)染表達(dá)miRNA的細(xì)胞后，如果野生型載體中報(bào)告基因的活性低于帶有突變結(jié)合位點(diǎn)的載體中報(bào)告基因的活性，可證明這個(gè)miRNA確實(shí)作用于該靶基因[4]。

我們的前期實(shí)驗(yàn)表明miRNA210與喉癌的多藥耐藥密切相關(guān)，我們通過(guò)Target數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出miRNA210的靶基因?yàn)镠TRA1及NUPR1[5]。本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因載體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NUPR1是miRNA210的作用靶點(diǎn)，即miRNA210可通過(guò)調(diào)控其靶基因NUPR1的表達(dá)影響喉癌的多藥耐藥性。

miRNAs與腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)，miRNA表達(dá)的改變可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，研究表明miR214同惡性腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)[6]，其調(diào)控機(jī)制與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。Blower等[7]系統(tǒng)的研究了miRNA與腫瘤耐藥的關(guān)系并發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)譜和抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用密切相關(guān)。另外對(duì)頭頸部鱗癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)抑制miR193a的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性。其機(jī)制是通過(guò)抑制p-73介導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)通路實(shí)現(xiàn)的[8]。也有研究表明miR212能夠調(diào)節(jié)類EGF肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子使頭頸部鱗癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性[9]。這些研究結(jié)果充分表明了miRNA在腫瘤的多藥耐藥中發(fā)揮著重要的作用，miRNA與其作用的靶基因組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控腫瘤的多藥耐藥性[10]。

MiRNA不僅在特定的細(xì)胞層面影響腫瘤細(xì)胞的藥物耐藥，而且在藥物的作用方式上也發(fā)揮作用。例如，miR-34a表達(dá)水平的增高與耐多西紫杉醇的乳腺癌細(xì)胞系有關(guān)。然而與之相反miR-34a表達(dá)水平的下降將會(huì)增加尤文氏肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素和長(zhǎng)春新堿的敏感性[11]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-126可以有效的結(jié)合在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFA)的3′非編碼區(qū)。而血管生成抑制劑貝伐單抗的作用靶點(diǎn)就在此區(qū)域。另外，miR-126的表達(dá)的升高可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，這就為靶向治療提供可能性[12]。

miRNA210在低氧條件下能夠抑制細(xì)胞增殖。越來(lái)越多的研究表明低氧微環(huán)境是導(dǎo)致腫瘤臨床治療效果差的主要因素之一,它能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗,同時(shí)也使其更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。多個(gè)miRNA參與了低氧反應(yīng)過(guò)程,而miRNA210是低氧條件下反應(yīng)變化最為顯著的miRNA之一[13]。miRNA210在頭頸腫瘤中的表達(dá)通常是升高的，miRNA210的表達(dá)可用來(lái)評(píng)定組織乏氧程度，同時(shí)也與頭頸癌患者的預(yù)后相關(guān)[14,15]。本組實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了miRNA210抑制物質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染到受體細(xì)胞中，結(jié)果表明抑制miRNA210的表達(dá)，喉癌細(xì)胞的存活率明顯降低，凋亡率明顯增高，喉癌多藥耐藥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均有明顯改變，喉癌細(xì)胞的多藥耐藥性明顯逆轉(zhuǎn)。

研究結(jié)果表明miRNA210靶基因?yàn)镹UPR1，抑制miRNA210的表達(dá)，可明顯增加喉癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，miRNA210可通過(guò)調(diào)控其靶基因NUPR1的表達(dá)影響喉癌的多藥耐藥性。本研究可為以mRNA尤其是以miRNA210為靶點(diǎn)的藥物開發(fā)及逆轉(zhuǎn)耐藥治療提供依據(jù)，進(jìn)而為提高喉癌化療的敏感性提供理論基礎(chǔ)，對(duì)喉癌的綜合治療有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。