上官文兵，李朝暉，張佳琦，韋 博*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 浙江310052；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130033)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼蛋白質(zhì)的RNA，長度大于200個核苷酸，通過對其下游靶基因的調(diào)控參與腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的多個過程[1,2]。最新研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，lncRNA FOXD2-AS1在黑色素瘤、肝癌、胃癌中高表達且促進腫瘤增殖及侵襲[3,4]。本研究利用siRNA 技術(shù)沉默lncRNA FOXD2-AS1基因，通過MTT法、平板克隆形成實驗和transwell小室等方法檢測沉默F(xiàn)OXD2-AS1后對膠質(zhì)瘤細胞增殖及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8.0 μm的transwell小室購自美國Millipore公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，MTT粉購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Giemsa染液購于上海源葉生物科技有限公司，DMSO 購于 Sigma-VETEC，si-FOXD2-AS1由百奧生物技術(shù)有限公司合成，siRNA序列：上游為5′-GCGAAGAGUACGUUGCUAUTT-3′; 下游為5′-AUAGCAACG UACUCUUCGCTT-3′。

1.2 細胞培養(yǎng)

人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251、A172均購自ATCC(American Type Culture Collection)，DMEM 高糖培養(yǎng)基、含 EDTA 0.25% 胰酶購自 GIBCO 公司，新生牛血清購自美國 Hyclone 公司。當(dāng)細胞匯合度達 80%以上時，棄去原培養(yǎng)基，加入1 mL胰酶消化細胞 2 min后加入1 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，800 rpm離心5 min。離心結(jié)束后加入一定量的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞并調(diào)整細胞密度重新接種于六孔板，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT assay

取轉(zhuǎn)染4 h后的膠質(zhì)瘤細胞，消化離心結(jié)束后用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞，96孔板中每孔接種5000個細胞，培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)4 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入 150 μl DMSO溶液，劇烈震蕩15 min溶解甲瓚，細胞能量代謝儀于490 nm處測定OD值。

1.4 平板克隆形成實驗

取轉(zhuǎn)染48 h后的膠質(zhì)瘤細胞，消化離心收集細胞，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞，以每孔200個細胞的密度接種于12孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。7-14 d后，棄去原培養(yǎng)液后每孔加入1 mL PBS 清洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛避光固定30 min，每孔加入1 mL Giemsa染液染色15 min。染色結(jié)束后PBS 清洗3次，觀察拍照并計數(shù)不同組的細胞克隆數(shù)。

1.5 Transwell小室

膠質(zhì)瘤細胞消化離心結(jié)束后用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞。以每孔1×105個細胞的密度接種于transwell上室內(nèi)。下室加入800 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，加入1 mL 4%多聚甲醛避光固定30 min，用Giemsa染料染色60 min，擦去濾膜上層細胞，于正置顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)穿過上室的相對細胞數(shù)。

1.6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

分別用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體和siRNA，輕輕混勻并室溫孵育后將混合物加入六孔板中，輕輕混勻后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6 h后，將培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LncRNA FOXD2-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力

為研究lncRNA FOXD2-AS1對膠質(zhì)瘤細胞增殖能力的影響，利用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)si-FOXD2-AS1，MTT法檢測不同時間點膠質(zhì)瘤細胞的增殖率時發(fā)現(xiàn)在96 h U251的增殖率為19.8%±1.09%，U251 si-FOXD2-AS1的增殖率為7.59%±0.615%，A172的增殖率為20.3%±1.12%，A172 si-FOXD2-AS1的增殖率為17.9%±0.720%。進行統(tǒng)計分析后，結(jié)果顯示：lncRNA FOXD2-AS1能夠促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力，且在48 h、72 h和96 h三個時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(如圖1A)。平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，U251的克隆形成數(shù)為119.3±11.0，U251 si-FOXD2-AS1的克隆形成數(shù)為90.33±7.51，A172的克隆形成數(shù)為162.3±50.2，A172 si-FOXD2-AS1的克隆形成數(shù)為21.00±2.65。如圖1B所示，沉默lncRNA FOXD2-AS1后克隆形成數(shù)明顯降低，提示沉默F(xiàn)OXD2-AS1后能夠有效降低膠質(zhì)瘤細胞U251和A172的克隆形成能力。

control組vs.si-FOXD2-AS1組* *P<0.01,*P<0.05

2.2 LncRNA FOXD2-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力

如圖2顯示，A172對照組穿過上室的細胞數(shù)為377.67±61.51，沉默F(xiàn)OXD2-AS1后穿過上室的細胞數(shù)為196.67±23.46；U251對照組穿過的細胞數(shù)為134.33±32.72，沉默F(xiàn)OXD2-AS1后穿過上室的細胞數(shù)為43.000±15.13，即沉默F(xiàn)OXD2-AS1后穿過上室的細胞數(shù)較對照組明顯減少，即FOXD2-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。

control組vs.si-FOXD2-AS1組*P<0.05,* *P<0.01

3 討論

LncRNA參與基因表達調(diào)控的多個過程，在腫瘤中起促癌或抑癌的作用，與腫瘤細胞增殖、凋亡、浸潤與轉(zhuǎn)移等多個惡性生物學(xué)過程密切相關(guān)[5]。有報道稱，lncRNA FOXD2-AS1在腫瘤中表達上調(diào)且促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1在甲狀腺乳頭狀癌中高表達，且與不良預(yù)后息息相關(guān)；Zhu等[7]研究證實，lncRNA FOXD2-AS1可作為大腸癌診斷和治療的潛在生物靶點；Su等[8]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1與膀胱癌的分期及復(fù)發(fā)相關(guān)，可作為預(yù)測膀胱癌復(fù)發(fā)的分子標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示沉默F(xiàn)OXD2-AS1基因能夠有效降低膠質(zhì)瘤細胞U251和A172的增殖率和克隆形成數(shù)，即lncRNA FOXD2-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。Transwell小室結(jié)果顯示lncRNA FOXD2-AS1有促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。綜上所述，我們的研究表明lncRNA FOXD2-AS1能促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖及遷移，進而促進膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為。因此，lncRNA FOXD2-AS1可作為膠質(zhì)瘤的一個分子標(biāo)記物，為膠質(zhì)瘤的基因靶向治療提供一個潛在靶點。