李 慧，李明賀，汪 洋，黃 蕾，周雪純

(1.首都醫(yī)科大學(xué)密云教學(xué)醫(yī)院 口腔科,北京101500；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 a.口腔頜面外科;b.正畸科)

正畸牙移動(dòng)的過程就是牙周組織改建的過程，研究牙周組織改建的機(jī)制對(duì)正畸臨床有重要的意義。雖然學(xué)者們[1,2]做了大量的研究，提供加速牙周組織改建的方法，即加速牙移動(dòng)的方法，如適當(dāng)?shù)慕o藥、物理方法的使用等，但這些方法的具體應(yīng)用仍處于探索階段。本研究旨在通過建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)模型，注射一氧化氮(NO)前體左旋精氨酸(L-Arg)，觀察CD133在大鼠牙周組織中的表達(dá)情況，本課題組前期研究[3,4]表明：CD133陽性細(xì)胞參與了實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織早期的血管改建，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其在牙周組織改建信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用，從而進(jìn)一步闡釋實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織改建的機(jī)制，并為L(zhǎng)-Arg的臨床相關(guān)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

取健康雄性6周齡Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為(0.15±0.02)kg，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組20只，按文獻(xiàn)[5]描述建立實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)動(dòng)物模型(在大鼠上頜切牙和右側(cè)第一磨牙之間放置NiTi螺簧，以大鼠的上頜切牙為支抗牙，用50 g力拉動(dòng)右上頜第一磨牙移動(dòng)向近中)，加力后立即采用L-Arg 300 mg·kg-1[6]溶解于0.5 mL生理鹽水中，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射等量生理鹽水，每天1次。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗大鼠CD133多克隆抗體(北京博奧森試劑公司)；免疫組織化學(xué)SP試劑盒(福州邁新公司)；L-Arg(美國 Sigma 公司)；防脫片劑：Poly-L-lysine多聚賴氨酸(福州邁新公司)。XL-I型正畸測(cè)力計(jì)(西北工業(yè)大學(xué))；病理圖文分析儀：HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué))。

1.3 標(biāo)本制作

在加力注射后的1、3、5、7、14 d用經(jīng)1‰DEPCS水處理過的4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注分別處死大鼠，制作牙周組織及牙的聯(lián)合標(biāo)本，用4%多聚甲醛將其固定過夜。經(jīng)常規(guī)脫鈣、脫水及石蠟包埋，制作5 μm厚的組織切片，以右上頜第一磨牙為中心、近遠(yuǎn)中方向。常規(guī)HE染色作組織的定位參照片，以CD133為一抗(1∶200)行SP法免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.4 鏡下觀察與圖像分析

1.4.1CD133陽性反應(yīng)灰度積分 CD133染色之后，從每組標(biāo)本的切片中隨機(jī)選取3張，光鏡下對(duì)比觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CD133陽性表達(dá)的分布情況。每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野(×200)測(cè)定CD133陽性反應(yīng)強(qiáng)度灰度，將其轉(zhuǎn)化為灰度積分(陽性產(chǎn)物面積/測(cè)量面積×陽性強(qiáng)度的灰度值)。

1.4.2CD133陽性新生血管計(jì)數(shù) 按Weidner方法[7]，首先低倍鏡下查找血管的密集區(qū)，再于高倍視野下(×200)計(jì)數(shù)每個(gè)視野含CD133陽性細(xì)胞的微血管數(shù)：即微小血管由2-3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇構(gòu)成，以下情況不計(jì)數(shù)：5個(gè)以上內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成管腔或管腔帶有較厚肌層、達(dá)8個(gè)紅細(xì)胞大小的血管。隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野，測(cè)定值取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

2.1.1HE染色 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相似，因機(jī)械牽拉牙周膜分為壓力側(cè)和張力側(cè)。壓力側(cè)牙周膜纖維排列紊亂，血管管腔變窄，破骨活躍，可見骨吸收陷窩；張力側(cè)牙周膜纖維排列具有方向性，牙周膜相對(duì)增寬，血管擴(kuò)張，成骨細(xì)胞排列成排，可見新骨形成。壓力側(cè)和張力側(cè)均可見新生血管。實(shí)驗(yàn)組大鼠的微血管結(jié)構(gòu)更豐富。見圖1和2。

2.1.2CD133免疫組織化學(xué)染色 各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的棕黃色顆粒陽性表達(dá)，在部分新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞胞漿中可見。相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組染色強(qiáng)度普遍高于對(duì)照組，尤其在加力3、5天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠CD133在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞中表達(dá)明顯。見圖3-6。

2.2 圖像分析

2.2.1實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織中CD133陽性反應(yīng)平均灰度積分 對(duì)照組CD133陽性反應(yīng)灰度積分

圖1 對(duì)照組7天牙周組織(HE,×100) 圖2 實(shí)驗(yàn)組7天牙周組織(HE, 圖3 對(duì)照組3天牙周組織CD133

圖4 實(shí)驗(yàn)3天組牙周組織CD133的表達(dá)(SP,×100)CD133染色陽性的新生血管較多 圖5 實(shí)驗(yàn)組3天牙周組織CD133的表達(dá)(SP,×200)成骨細(xì)胞CD133染色陽性 圖6 實(shí)驗(yàn)組5天牙周組織CD133的表達(dá)(SP,×200) 箭頭所指為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞CD133染色陽性

高峰出現(xiàn)在加力后1 d，實(shí)驗(yàn)組在加力后5 d出現(xiàn)最高值，峰值落后于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組在加力3、5 d時(shí)表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠CD133陽性反應(yīng)平均灰度積分

注：NS無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2.2實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織中CD133陽性新生血管計(jì)數(shù) 加力1天后在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠中均觀察到CD133表達(dá)陽性的新生血管，且對(duì)照組達(dá)高峰，實(shí)驗(yàn)組在加力3天達(dá)高峰，且明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠CD133陽性新生血管計(jì)數(shù)

注： NS無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

實(shí)現(xiàn)牙移動(dòng)需要通過牙周組織的改建[8]，牙齒移動(dòng)速度和正畸矯治療程取決于牙周組織的改建水平。CD133是一種跨膜蛋白，是研究最多、較有研究?jī)r(jià)值的干細(xì)胞表面特異標(biāo)記分子之一,通過CD133 可以分選干細(xì)胞及前體細(xì)胞等[9]，排除成熟內(nèi)皮細(xì)胞。目前，CD133 的生物學(xué)功能還未完全明確，僅是其參與的信號(hào)通路與干細(xì)胞激活有關(guān)被基本確認(rèn)[10]。在組織缺血、缺氧等內(nèi)源性刺激以及加入生長(zhǎng)因子、藥物等外源性刺激的生理或病理?xiàng)l件下，骨髓中的造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞將被動(dòng)員進(jìn)入外周血并歸巢參與組織中血管改建部位[11]。已有研究顯示加入細(xì)胞因子，激素或藥物等外源性刺激[12]可促進(jìn)其的動(dòng)員歸巢。

本研究選用L-Arg作為外源性刺激。L-Arg是NO的前體也是促進(jìn)劑，其在內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生的NO與細(xì)胞吸收的L-Arg幾乎配對(duì)。外源性L-Arg能增加血管NO生物活性，并能明顯促進(jìn)NO合成和造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖。而NO是最重要的一種內(nèi)皮源性血管活性因子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng)，具有擴(kuò)張血管、信息傳遞、組織修復(fù)等作用。NO途徑是一種重要的新血管形成的調(diào)節(jié)器，而且可以調(diào)節(jié)成血管細(xì)胞活性，影響其增殖，動(dòng)員和遷移通過局部缺血及慢性損傷反應(yīng)。研究[13]表明NO可調(diào)節(jié)造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓的釋放，對(duì)動(dòng)員其入血起了關(guān)鍵作用。Qi等[14]的研究顯示：外源性增加NO可顯著提高循環(huán)造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞水平。而增加NO及提高其生物利用度則可以使造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙得以恢復(fù)[15]。NO介導(dǎo)的信號(hào)通路更被認(rèn)為是造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的基礎(chǔ)[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠在牙周組織受到正畸力后，CD133有少量表達(dá)；而在受力3-5 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的CD133陽性反應(yīng)平均灰度積分明顯高于對(duì)照組，即注射L-Arg后，在一段時(shí)間內(nèi)CD133陽性表達(dá)確有增高。而實(shí)驗(yàn)組中CD133陽性新生血管表達(dá)也在一段時(shí)間內(nèi)高于對(duì)照組，說明加入外源性刺激L-Arg促進(jìn)了牙周組織改建中CD133陽性細(xì)胞數(shù)量的增多及作用的發(fā)揮。分析機(jī)制可能為NO是骨髓微環(huán)境的組成和調(diào)節(jié)成分，加入L-Arg促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放NO，進(jìn)而促使基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的激活，從而促進(jìn)CD133陽性細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢[17]。而也正是由于這一過程使得CD133在實(shí)驗(yàn)組的牙周組織及新生血管中的表達(dá)高峰與對(duì)照組相比均后移。

實(shí)驗(yàn)組中CD133在牙根周圍牙槽骨表面成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中表達(dá)較對(duì)照組明顯，提示L-Arg促進(jìn)CD133陽性細(xì)胞通過成骨細(xì)胞分化參與早期實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織的骨改建。原因可能為雖然骨改建的發(fā)生很大程度上受血管化作用的影響，但已有研究表明造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞，既能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，也能分化成為成骨類細(xì)胞[18]。另有證據(jù)也表明，早期和功能性高活性的CD34/CD133+循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞具有成骨潛能[19]。在其基礎(chǔ)上由于NO對(duì)骨的作用，即NO是骨反應(yīng)的重要媒介，其在進(jìn)行骨改建及破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的功能分化過程中均起了重要的調(diào)控作用。因此注射L-Arg后，可見破骨活躍，破骨細(xì)胞活化明顯，成骨也被促進(jìn)，使得CD133陽性細(xì)胞的成骨分化增強(qiáng)。

綜上所述，L-Arg通過上調(diào)實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織中CD133的表達(dá)，促進(jìn)CD133陽性細(xì)胞參與實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)的牙周組織改建，從而在促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)牙周組織的血管改建與骨改建方面發(fā)揮了作用。