王德利,尹顯貴，楊 華，李 赫

(1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春130012；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊 第964醫(yī)院，吉林 長春130062； 3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021)

S100A10又被稱為p11，屬于S100家族成員，是一種鈣離子結(jié)合蛋白，在細胞內(nèi)外發(fā)揮多種功能[1]，與膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)形成異源四聚體AIIt中被發(fā)現(xiàn)[2]。在生理狀態(tài)下AIIt定位在細胞的內(nèi)膜及外膜上，其中外膜上的AIIt為纖溶酶原(plasminogen)和組織纖溶酶原激活劑(tPA)提供錨定位點[3]，是調(diào)控腫瘤細胞遷移與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白復(fù)合體，被認為是腫瘤治療的一個潛在靶點。有文獻研究表明，當S100A10與ANXA2形成復(fù)合體時，其半衰期增加，而在不與ANXA2結(jié)合時會被泛素化降解[4]，因而在細胞中的豐度較低，這為研究其功能帶來了困難。同時，由于S100A10同源二聚體結(jié)構(gòu)的特性，其N端和C端都參與了AIIt的形成，即與ANXA2 N端的相互作用。因此，為了能進一步研究S100A10蛋白的功能及以其為靶點進行藥物篩選，我們利用大腸桿菌表達體系表達并純化了不帶有標簽的野生型S100A10蛋白，并通過Western Blot及ANXA2-GST融合蛋白pull-down實驗進行鑒定。

1 材料

菌株：DH5a感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BL21(DE3)感受態(tài)細胞為本實驗室保存。

載體：pEXS-DH原核表達載體改造自pET-28a，為中科院生物物理所孫飛組惠贈。

DNA聚合酶fast pfu購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司。

S100A10鼠單抗購自Cell Signaling公司；ANXA2鼠單抗購自Santa Cruz公司；HRP標記的羊抗鼠二抗購自Pierce公司。

2 方法

2.1 野生型S100A10原核表達載體的構(gòu)建

以人肝癌細胞HepG-2的cDNA為模板，設(shè)計以下引物：P11_F:5’-ccgCATATGCCATCTCAAATGGAACACGCC-3’(NdeI),P11_R:5’-ccgCTCGAGCCttaCTTCATGTGTACTACAAAA-

TAGTCATT-3’(XhoI)。其中在反向引物中人為加入了終止密碼子，確保翻譯后的蛋白質(zhì)C端與野生型相同。利用標準的PCR技術(shù)擴增出目的片段，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。用限制性內(nèi)切酶NdeI/XhoI雙酶切目的片段及pEXS-DH空載體，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。用T4 DNA連接酶按片段/載體摩爾比3:1室溫連接雙酶切產(chǎn)物2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，結(jié)果為陽性的送測序。

2.2 野生型S100A10的原核表達

將測序結(jié)果正確的S100A10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆在37℃進行擴大培養(yǎng)。待OD達到0.6時將搖床降溫至16℃，加入終濃度0.4 mM的IPTG進行誘導(dǎo)，繼續(xù)16℃培養(yǎng)20 h，進行S100A10蛋白的表達。

2.3 野生型S100A10的初步純化

由于本實驗中設(shè)計表達的野生型S100A10表達量大且不帶有標簽，因此采用硫酸銨沉淀法進行第一步純化。4℃ 4 000 g離心30 min收集菌體，用0.1M Tris,100 mM NaCl Buffer pH7.5重懸，加入終濃度0.1 mg/ml的溶菌酶，超聲裂解。裂解后4℃ 20 000 g離心30 min，收集上清。在上清中加入硫酸銨固體，同時在冰上攪拌，直至硫酸銨不再溶解，冰上攪拌6 h，讓蛋白質(zhì)充分沉淀。4℃ 10 000 g離心30 min,收集沉淀，用2 ml 0.1M Tris,100 mM NaCl Buffer pH7.5溶解沉淀，20 000 g離心30 min,取上清加入終濃度18%飽和度的硫酸銨，冰上攪拌過夜，用相同的方法處理后濃縮至2ml，用Superdex75 分子篩進一步純化。

2.4 野生型S100A10的精細純化

將初步純化后的樣品上樣Superdex75 分子篩，利用Bio-Rad Duoflow蛋白純化系統(tǒng)進行精細純化，收集保留體積大于14 ml的組分，在12% SDS-PAGE檢測目的蛋白純度。

2.5 純化后S100A10的功能鑒定

通過驗證純化所得S100A10能否與ANXA2結(jié)合來驗證其部分功能。利用純化的C端帶有GST標簽的ANXA2(ANXA2-CG)與S100A10冰上孵育1 h，掛GST親和層析柱(柱A)；先將ANXA2-CG掛GST柱，而后再向柱子中加入純化所得的S100A10(柱B)。取AB兩柱中等量的GST介質(zhì)制成電泳樣在12% SDS-PAGE上檢測。

3 結(jié)果

3.1 野生型S100A10原核表達載體的構(gòu)建

我們成功擴增出了大小約為280 bp的目的片段，最終測序結(jié)果顯示載體構(gòu)建正確。見圖1。

A.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳的結(jié)果；B.雙酶切鑒定結(jié)果

3.2 利用硫酸銨沉淀法初步純化野生型S100A10

首先將全蛋白沉淀用1/15M Na2HPO4-KH2PO4pH5.5 buffer稀釋至100 ml,分別各取2 ml加入到不同濃度的硫酸銨溶液中，4℃搖床上輕搖過夜，進行硫酸銨梯度濃度篩選。次日10 000 g離心30 min，取沉淀用pH7.5 buffer溶解，20 000 g離心30 min，取上清經(jīng)12% SDS-PAGE檢測目的蛋白純度。由于S100A10異源二聚體分子量為22kd，為了后續(xù)能夠進行分子篩純化時保證其與大分子量雜蛋白的分離度，硫酸銨最適濃度為15%-20%飽和度之間，因此我們選擇18%飽和度的硫酸銨作為沉淀條件進行純化。見圖2。

上圖為硫酸銨濃度梯度篩選結(jié)果，下圖為用18%飽和度的硫酸銨進行純化后的結(jié)果

3.3 利用Superdex 75對S100A10進行精細純化

通過分子篩結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，S100A10在分子篩上峰尖位置與預(yù)測一致但峰形較寬，為了保證精細純化后蛋白的純度，舍棄與大分子量雜蛋白同時流出的部分，最終純化結(jié)果如圖3。

3.4 與ANXA2-CG的pull-down實驗

我們采用兩種掛柱方式來驗證純化后S100A10與ANXA-CG的結(jié)合能力，并通過Western Blot進行了蛋白鑒定。結(jié)果顯示兩種掛柱方式都能讓純化后的S100A10與ANXA2-CG結(jié)合，且等量ANXA2-CG結(jié)合的S100A10蛋白量不同，這與我們的實驗預(yù)期相符，同時說明兩者的結(jié)合是特異性的相互作用。見圖4、5。

4 討論

S100A10蛋白異源二聚體分子量僅為22kd，但其結(jié)構(gòu)較為精細，二聚體上包含有鈣離子結(jié)合位點[5]、AHNAK結(jié)合位點[6]、SMARCA3結(jié)合位點等[7]功能區(qū)域，更重要的是二聚體中一分子S100A10的N端與另一分子S100A10的C端一起組成了ANXA2 N端結(jié)合口袋，盲目的在S100A10 N端或C端添加純化用標簽都可能影響其與ANXA2結(jié)合的功能，在本實驗室的前期工作中我們表達并純化了C端帶有8*His標簽的S100A10，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可溶性較差且不會與ANXA2-CG結(jié)合。

上圖為經(jīng)18%飽和度硫酸銨沉淀純化后的S100A10在Superdex 75分子篩上的層析圖。下圖為收集器中每管樣品經(jīng)12%SDSPAGE后考染結(jié)果，利用已純化好的ANXA2(分子量36kd)在同一根上Superdex 75進行排阻層析作為對照(層析圖未放入)。

上圖為兩種pull-down方式的模型示意圖；下圖為用AB兩柱GST介質(zhì)制成電泳樣經(jīng)12%SDS-PAGE后的考馬斯亮藍染色結(jié)果及Western Blot結(jié)果。

因此我們構(gòu)建了不含有標簽的S100A10表達載體，并依照S100A10蛋白的性質(zhì)進行純化實驗設(shè)計。

考慮到野生型S100A10的等電點為5.5，在純化初期我們先用偏中性的buffer(pH 7.5)將裂解液上清中全蛋白盡可能的沉淀下來，而后用pH為5.5的buffer溶解沉淀并再次進行硫酸銨沉淀，在降低目的蛋白溶解度的情況下，盡可能的除去雜蛋白，為后續(xù)的高效液相色譜純化提供純度較高的樣品，達到了很好的純化目的。和S100A10相比，S100家族其他成員也具有等電點偏酸性，分子量小，二體化，配體結(jié)合位點多等特點，因此本實驗技術(shù)對于純化其他S100家族蛋白也具有重要的參考意義。

黑色為S100A10的N端和C端，白色為ANXA2的N端(PDB ID:4HRE)。