(首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室,北京 100069)

囊泡主要集中在每個神經(jīng)元的突觸前神經(jīng)末梢。它們儲存神經(jīng)遞質(zhì)并在動作電位使突觸前膜去極化時，神經(jīng)遞質(zhì)釋放后與突觸后膜上的受體結(jié)合，釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的種類決定了下游神經(jīng)元是去極化還是超極化。在胞吐作用后，囊泡發(fā)生內(nèi)吞，再循環(huán)并重新填充神經(jīng)遞質(zhì)。已知囊泡表面的蛋白就有大概40種左右[1]，參與其釋放的蛋白也有很多種，這些分子蛋白相互作用，高度有序，并且受到了精密控制[2]。其失調(diào)可導(dǎo)致許多身體和心理的疾病，如帕金森病，阿爾茨海默病，抑郁癥,藥物成癮和癲癇。研究神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過程，不僅會對神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究產(chǎn)生積極的影響，也將揭示與其相關(guān)的重大疾病理論機理，為其治療提供新的靶點。

1 目前研究方法

1.1 電鏡

電鏡方法主要用于測量囊泡的一些物理特征，比如說囊泡的大小，分布，密度和形態(tài)。透射電子顯微鏡(TEM)是用于描述囊泡特征的最普遍的技術(shù)，在透射電鏡中，聚焦的電子束通過薄樣本傳輸以產(chǎn)生樣本圖像。處理樣品的重金屬如四氧化鋨和醋酸鈾使脂質(zhì)膜產(chǎn)生對比。TEM具有卓越的分辨率。另外，TEM還可與免疫標(biāo)記(免疫EM)結(jié)合，以提供分子特征[3]。掃描電子顯微鏡(SEM)是研究囊泡的一種成熟且有用的技術(shù).掃描電鏡通過用聚焦的電子束掃描囊泡表面來觀察囊泡; 電子與樣品中的原子相互作用，產(chǎn)生各種可誘導(dǎo)信號，提供三維表面形貌信息以及樣品的元素組成。主要用于研究胞外的囊泡[4]。由于絕大多數(shù)關(guān)于囊泡的掃描電鏡的研究是在真空下進(jìn)行的，因此樣品通常是固定和脫水的。冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)是電鏡的一種形式，其中樣品在非常低的溫度(例如，-100℃)下進(jìn)行分析.與需要大量樣品固定和染色的SEM或TEM不同，冷凍電鏡在冷凍條件下分析樣品中囊泡，避免受到脫水和化學(xué)固定劑的影響[5]。

1.2 光學(xué)

由于熒光染料的開發(fā)和顯微成像技術(shù)的發(fā)展，使用光學(xué)方法檢測囊泡實時釋放的應(yīng)用越來越多[6,7]。FM1-43是研究囊泡釋放的常用的膜表面熒光標(biāo)記物,其在水相中不發(fā)熒光, 插入脂質(zhì)膜后則產(chǎn)生較強的熒光, 因此囊泡釋放后細(xì)胞的膜表面熒光強度增加, 而囊泡胞吞時因為吞進(jìn)周圍的染料而被熒光標(biāo)記,這樣便能夠?qū)崟r觀察遞質(zhì)釋放的過程，此方法背景熒光較大。另一種背景熒光小的方法是通過轉(zhuǎn)基因?qū)晒饣蛉缇G色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并選擇性地在囊泡膜上表達(dá)[8]。Yulong Li等最近通過在乙酰膽堿，多巴胺和去甲腎上腺素受體特定位置嵌入循環(huán)重排的熒光蛋白，當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放后，作用到受體時，激活的受體構(gòu)象就會發(fā)生變化，構(gòu)象的變化就會導(dǎo)致熒光蛋白的熒光信號發(fā)生改變，進(jìn)而反映對應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化。Lin Tian小組也開發(fā)了類似的探針。這種傳感器不僅在監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面具有高度選擇性，而且在體內(nèi)和離體模型中也提供了非常高的時間(亞秒)和空間分辨率(從全腦切片到單個神經(jīng)元)[9-11]同時克服了基于G蛋白偶聯(lián)受體的傳感器在體內(nèi)使用的一些限制[12]。并且應(yīng)用范圍從單細(xì)胞到在體清醒模型都可以。

全內(nèi)角反射熒光顯微鏡(Total Internal Reflect Fluorescence Microscopy, TIRFM)方法的原理是利用光在高折射率和低折射率的交界面，當(dāng)入射角達(dá)到或超過某個臨界角度時，發(fā)生全反射形成隱失場，使用隱失場激發(fā)熒光樣品，激發(fā)的厚度大概只有100nm，其它的熒光基團不會被激發(fā)，因此信噪比很高，特別適合神經(jīng)遞質(zhì)釋放和內(nèi)吞方面的研究應(yīng)用。

1.3 電學(xué)

1.3.1膜電容

膜電容方法是通過膜片鉗放大器記錄細(xì)胞膜表面積的變化來估算刺激的細(xì)胞胞吐所引起電容變化的方法。膜電容與細(xì)胞的表面積成正比，當(dāng)分泌的囊泡與胞膜融合時，膜電容增加。此方法主要用于單細(xì)胞和組織切片，用于檢測標(biāo)本的范圍比較窄。

1.3.2突觸后電流

此方法就是利用釋放的神經(jīng)遞質(zhì)作用到突觸后特異性受體引起電流來研究神經(jīng)元遞質(zhì)釋放?？斓呐d奮性和抑制性遞質(zhì)如谷氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，和乙酰膽堿可以直接激活離子通道，記錄到突觸后細(xì)胞或膜片的電流。這個技術(shù)被廣泛的用于研究腦組織中GABA 和谷氨酸釋放的調(diào)節(jié)，自發(fā)性的突觸后電位頻率與動作電位誘發(fā)的遞質(zhì)釋放的概率有關(guān)[13]。

1.4 電化學(xué)技術(shù)

電化學(xué)技術(shù)的原理是:給予電極表面一定的電壓,容易氧化的神經(jīng)遞質(zhì)就會在電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)而釋放電子,電極獲得電子并產(chǎn)生電流。由于碳的電化學(xué)特性穩(wěn)定，材質(zhì)堅韌，且原材料容易獲得，也容易加工成直徑小的纖維(5～35 μm)，對組織損傷小，因此電化學(xué)電極原料大多為碳。

碳纖電極：電化學(xué)方法在生物體的應(yīng)用主要是恒壓安培法和循環(huán)伏安法。前者的優(yōu)點是時間分辨率高, 后者的優(yōu)點是能區(qū)分不同的信息分子。1973年Adams等將碳電極植入麻醉大鼠的大腦中，并且證明了傳統(tǒng)的伏安法可以應(yīng)用于生物組織。盡管當(dāng)時所記錄的信號可能是抗壞血酸而非多巴胺，但這項工作的重要性是證明了神經(jīng)遞質(zhì)可以擴散到突觸間隙外的電極表面，如果這種情況不存在，在體電化學(xué)測量是不可能的[14]。在這之后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用，電化學(xué)方法用于腦片中的神經(jīng)遞質(zhì)測量始于上世紀(jì)70 年代，而應(yīng)用于單細(xì)胞遞質(zhì)分泌測量則是在90年代Wightman小組完成[15]。而在進(jìn)入20世紀(jì)后，Wightman小組又率先實現(xiàn)了自由活動狀態(tài)的大鼠的多巴胺記錄[16]。電極可以分為柱狀電極和點狀電極。柱狀電極主要應(yīng)用于在體和腦片，檢測的是很多囊泡的釋放，空間分辨率達(dá)不到單個囊泡的水平。點狀電極主要應(yīng)用于單細(xì)胞，無論是時間(毫秒)還是空間分辨率(單囊泡)都能保證對分泌囊泡數(shù)量、單個囊泡的容量等研究的需要[17,18]。

酶修飾電極：由于碳纖電極只能檢測可以被氧化的神經(jīng)遞質(zhì)，主要是多巴胺和去甲腎上腺素，但有很多重要的神經(jīng)遞質(zhì)不能被500～700mV的電壓所氧化，通常通過對電極表面固定特定的氧化酶從而形成H2O2來完成分析物檢測。例如，主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的檢測可以通過谷氨酸氧化酶來實現(xiàn)，谷氨酸氧化酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸和H2O2[19]。由于酶的動力學(xué)可以減慢這種測量的時間分辨率，因此基于酶的傳感器通常與安培法聯(lián)合。已經(jīng)開發(fā)了許多種基于安培法的酶的傳感器，包括谷氨酸[19]，乙酰膽堿[20]及其前體膽堿[21]和腺苷[22]。

1.5 微透析-高壓液相色譜-電化學(xué)檢測方法

微透析(Microdialysis)：微透析技術(shù)是將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合用于活體組織動態(tài)微量采樣的技術(shù)。其原理是將具有透析作用的探針埋入目標(biāo)組織內(nèi)，用微量注射泵以恒定速度向探針內(nèi)灌注與組織液成分相近的等滲灌流液，與待測的組織進(jìn)行物質(zhì)交換后被引流出。聯(lián)合高壓液相色譜檢測技術(shù)便可檢測特定組織內(nèi)生物活性物質(zhì)的變化。此技術(shù)具有活體取樣，定量分析，動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點。

高壓液相色譜(high pressure liquid chromatography, HPLC)色譜法又稱層析法，是常用的分離物質(zhì)的方法。其原理為溶質(zhì)在流動相和固定相之間進(jìn)行的連續(xù)多次交換過程。由于溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。根據(jù)各組分在固定相中保留時間不同，就可以定性定量檢測神經(jīng)遞質(zhì)。

2 討論和應(yīng)用

電鏡技術(shù)是神經(jīng)元中遞質(zhì)釋放的傳統(tǒng)研究方法，電鏡的空間分辨率是其它方法無法企及的， Bernard Katz根據(jù)記錄到的終板電位的固定振幅的小的自發(fā)去極化，提出了量子假說[23]。 然而，只有在電鏡中看到突觸囊泡才使其量子假設(shè)細(xì)化為囊泡假說。另外Palade提出的囊泡運輸假說也是根據(jù)電鏡結(jié)果得出的[24]。需要以納米分辨率成像的膜和蛋白質(zhì)的研究，離不開電鏡方法。與免疫電鏡相比，最近的超微結(jié)構(gòu)研究利用可切換的熒光蛋白質(zhì)將電子顯微鏡和超分辨率顯微鏡結(jié)合成像(稱為納米-fEM)[25],大大提高了標(biāo)記的靈敏度。

通過光學(xué)的方法，可以直接實時動態(tài)觀察到熒光標(biāo)記的分泌囊泡。這樣就可以看到囊泡釋放的一系列進(jìn)程。在最近的一項研究中，Kylachko及其同事利用高熒光強度苯乙烯基染料SGC5，檢測了自發(fā)的或由動作電位誘發(fā)的染料攝取后單個突觸囊泡的運動軌跡[26]，發(fā)現(xiàn)自發(fā)的釋放引起內(nèi)吞的囊泡的活動范圍比動作電位引起的內(nèi)吞的囊泡更小。另外，熒光蛋白可以通過電穿孔，病毒注射或基因組整合來表達(dá)，從而可以穩(wěn)定和長期表達(dá)，用于長期監(jiān)測神經(jīng)元活動。 另外還可以通過使用特異性啟動子或定位序列來實現(xiàn)靶向神經(jīng)元亞型或細(xì)胞器?？傊S著染料和顯微鏡以及圖像傳感器的發(fā)展，光學(xué)的方法越來越受到科研工作者的青睞。

電學(xué)方法也可以用來實時檢測囊泡的分泌，該技術(shù)的優(yōu)點是對囊泡釋放的時間分辨率高。興奮性突觸后電流和抑制性突觸后電流常用來檢測谷氨酸和氨基丁酸的釋放，但此方法是突觸前釋放的神經(jīng)遞質(zhì)作用到突觸后受體的綜合結(jié)果，本質(zhì)上是一種間接的方法，而且受到神經(jīng)遞質(zhì)的擴散和消除，受體失敏和受體飽和等影響。從突觸后反應(yīng)中獲得突觸前行為需要復(fù)雜的反卷積算法，這些算法依賴于對實驗條件的假設(shè)。另一個常用的電學(xué)方法膜電容測量則是對囊泡釋放的直接測量。常用來研究遞質(zhì)釋放與離子通道以及細(xì)胞內(nèi)第二信使的關(guān)系。此方法為研究囊泡的活動如膜融合動力學(xué)、膜融合的分子調(diào)控等提供了強大的工具。但由于胞吐同時伴隨胞吞，胞吞導(dǎo)致的囊泡膜的回收會使膜電容減少。此方法還有一個假設(shè)就是囊泡內(nèi)含有神經(jīng)遞質(zhì)，囊泡完全與胞膜融合以及囊泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)完全釋放，但已經(jīng)證實還存在其它的釋放方式。還有就是此方法對實驗條件如封接電阻(Rm)、串聯(lián)電阻(Rs)的要求很高, 對于一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)如神經(jīng)軸突終末、或與周邊細(xì)胞有電學(xué)偶聯(lián)的細(xì)胞等則不能使用該技術(shù)。總體來說電學(xué)的方法雖然具有高分辨率的優(yōu)勢，但都主要應(yīng)用在單細(xì)胞或腦片層面上，用于在體研究神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的比較少。

在體腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的研究主要依賴于微透析-高壓液相色譜和電化學(xué)微電極檢測方法。通過微透析結(jié)合高壓液相色譜來采樣和測定腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，其分析過程比較長，樣品收集時間間隔為5～30分鐘。時間分辨率比較低，無法實時測定腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化。它的優(yōu)點在于它的很高的靈敏度和分辨率，缺點在于它的時間和空間分辨率不夠高。這些年電化學(xué)微電極發(fā)展也取得了很大的進(jìn)步，在在體水平和腦片水平上以及單細(xì)胞水平上都能記錄多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。時間和空間分辨率都優(yōu)于微透析-高壓液相色譜。

現(xiàn)在很多關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)的研究都是結(jié)合多種方法，例如在有些蛋白丟失其功能的情況下，囊泡的分布會發(fā)生變化，同時其動力學(xué)也可能會發(fā)生變化，這時候電學(xué)結(jié)合電鏡或光學(xué)的方法就會使時間和空間分辨率都很高[27]。而如果囊泡的大小發(fā)生變化，除了電鏡觀察囊泡的直徑外，還可以測突觸后電流或用微碳纖電極來進(jìn)一步驗證。2018年Shin W研究囊泡釋放動力學(xué)就用到了電容，電鏡和光學(xué)[28]。而Zhou Zhuan 實驗組最新發(fā)現(xiàn)的一種新的不依賴于鈣離子的分泌方式也涉及到了電容，電鏡和全內(nèi)反射顯微鏡等多種研究方法[29]。這些方法的結(jié)合可以相互彌補各自的缺點，同時又相互印證。