季宏建孫劍華

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院藥學院，鹽城 224005；2.鹽城市第三人民醫(yī)院 藥學部，鹽城 224005)

高效液相色譜法(HPLC)具有其他色譜法無可比擬的優(yōu)勢，具有檢測速度快、分離效能高、檢測靈敏度高、選擇性好、應用范圍廣等特點[1，2]，廣泛應用于食品、藥品檢測和臨床分析等方面[3-5]。流動相、固定相是決定物質(zhì)能否被高效分離的關(guān)鍵因素。本文從影響流動相和固定相的各因素(物理因素、化學因素)入手，詳細研究了高效液相色譜的維護方法。

1 與流動相相關(guān)的研究內(nèi)容

1.1 外部因素(物理因素)對流動相的影響

1.1.1儲液瓶

流動相儲液瓶是一個簡單但很重要的HPLC部件。首先，儲液瓶的材質(zhì)需要對流動相保持惰性。液相用的大部分儲液瓶是由玻璃制成，因此實驗室的玻璃器皿，厚玻璃瓶等都可以作為儲液瓶，但是基于流動相防塵、防污染、防真空等要求，必須提供為液相色譜特殊設計的儲液瓶。儲液瓶需要用蓋子之類的物品保護，免受灰塵的污染，以及減少流動相的揮發(fā)。但同時蓋子也不能蓋得太緊，否則在流動相泵出時易產(chǎn)生容器內(nèi)真空，導致斷流。

1.1.2過濾

如果HPLC系統(tǒng)中存在顆粒雜質(zhì)，那么系統(tǒng)的比例閥、單向閥、管路、色譜柱、進樣閥等都無法良好運行，并會導致磨損，因此，使用沒有顆粒雜質(zhì)的流動相是基本要求。市售的HPLC級的溶劑和實驗室準備的HPLC級別水，使用前要通過0.45μm 或0.22μm的微孔濾膜過濾。流動相中加入了其他組分(例如緩沖鹽、離子對試劑等)，也是必須要過0.45μm 或0.22μm的微孔濾膜的。

1.1.3脫氣

只要空氣在流動相里保持溶解，氣泡問題就很少會出現(xiàn)，但若是被氣體飽和的溶液，只要非常小的壓力下降就能導致氣泡逸出。以純水和純甲醇為例，若它們被暴露在空氣中，就會分別被空氣飽和，而空氣在甲醇/水混合溶劑里面的溶解度與甲醇濃度有關(guān)，低于其在甲醇和水中溶解度之和，當兩種溶劑混合后，混合液中氣體會過飽和，便迅速以氣泡形式逸出。因此，為了增加HPLC操作的可靠性，必須以適當?shù)姆椒?超聲波脫氣、過濾脫氣、在線脫氣等)對流動相脫氣。

1.1.4保存期限

配好的流動相都有一定的保存期限，因此為避免流動相變質(zhì)而導致浪費，建議根據(jù)實際實驗情況和有效期，合理配制一次所需的用量。在將配制好的新鮮流動相倒入儲液瓶前，需先將儲液瓶潤洗3次。然后把填寫好的《儲液瓶標簽》(內(nèi)容包括流動相成分、配比、配制人、配制日期及有效期等信息)粘貼到儲液瓶上。

1.2 內(nèi)部因素(化學因素)對流動相的影響

1.2.1pH值的影響

流動相的pH值應控制在2～7之間。當pH值大于7時可使硅膠載體溶解；當pH值小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于7的流動相時，應選用耐堿的填充劑；當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑。

1.2.2緩沖鹽的水相溶液的影響

含有緩沖鹽的流動相應盡可能少用，必須使用時，緩沖鹽的濃度應盡可能低，否則容易阻塞管路。由于十八烷基鏈在純水相溶液中易產(chǎn)生彎曲，所以對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中水相溶液的比例通常應低于95%，否則C18鏈的隨機彎曲將引起組分保留值變化，導致色譜系統(tǒng)的重現(xiàn)性很差。

1.2.3流動相的組成比例、變化幅度的影響

流動相的成份不能隨意改變，但是比例可適當調(diào)整。每次調(diào)整流動相組成比例時，以組分比例較低者(小于或等于50%)相對改變量不超過±30%且絕對改變量不超過±10%為宜，如40%相對改變量的數(shù)值超過30%時，則絕對改變量以±10%為宜。

2 與固定相(色譜柱)相關(guān)的研究內(nèi)容

2.1 影響色譜柱使用壽命的原因

2.1.1色譜柱篩板問題

篩板位于色譜柱的入口處，容易發(fā)生堵塞。篩板堵塞會產(chǎn)生柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問題。樣品中含有微粒是導致篩板堵塞的主要原因。因此，為了避免此類問題的發(fā)生，必須在進樣前將樣品過0.45μm的濾膜。

2.1.2強保留樣品組分

強吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能嚴重地縮短色譜柱壽命。分析生物組織或體液(如血漿)的提取物、含油劑等復雜樣品時，這種滯留組分的影響尤其嚴重。色譜柱應用中，色譜峰嚴重拖尾或分叉的出現(xiàn)往往是強保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。在進樣閥與色譜柱之間加/支保護性的小預柱，能夠有效減少強吸附組分對色譜柱的污染。小預柱通常為填充良好的1～2cm的短柱，內(nèi)裝有與色譜柱相當?shù)奶盍?。需要注意的是小預柱必須定期更換。

2.2 色譜柱的清洗與再生

2.2.1反相色譜柱的清洗與再生

常規(guī)樣品污染的硅膠基質(zhì)色譜柱，一般選用溶劑強度逐漸增大(極性逐漸減弱)的溶劑清沖洗，強疏水性的溶劑清洗非極性物質(zhì)，如脂類。最常用的方法是用20倍柱體積(柱體積指色譜柱內(nèi)空腔體積，4.6x250mm色譜柱的柱體積為4.2mL)的乙腈 (或甲醇)∶水=90∶10(V/V) →乙腈→二氯甲烷→乙腈→乙腈(或甲醇)∶水=90∶10(V/V)沖洗色譜柱。需要注意的是在清洗和再生的過程中，需要保證每種清洗溶劑和下一種清洗溶劑互溶。當金屬離子污染色譜柱后，必須使用特殊的溶劑(磷酸和0.1mol/L檸檬酸)清洗色譜柱，才能得到再生。

2.2.2正相色譜柱的清洗與再生

正相色譜柱的清洗與再生的方法與反相色譜柱相反，用極性逐漸增強的溶劑沖洗。常用的方法正己烷→異丙醇→二氯甲烷→甲醇→二氯甲烷→異丙醇→正己烷沖洗，每種溶劑不少于20倍柱體積。

3 結(jié)語

在HPLC的使用過程中，務必做到一絲不茍，對儀器運行時的各種數(shù)據(jù)及時記錄，這是對維護儀器的最重要的資源。在診斷儀器故障時，可應用單因素交替法，配合零部件替代法，迅速查出故障所在，并進行維護?？傊胧笻PLC處于高效運行狀態(tài)，務必做好試樣的前期處理，同時務必做好儀器的正確使用和維護。