趙興麗，卯婷婷，張金峰，孟澤洪，李 帥，周玉鋒*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006）

土壤是茶樹營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育的重要場所，是茶葉生產(chǎn)的基礎(chǔ)，土壤質(zhì)量的好壞直接或間接影響茶葉品質(zhì)與產(chǎn)量。根際土壤與植物聯(lián)系最為密切，根際土壤內(nèi)生存的微生物是根際微生態(tài)的重要組成部分[1]，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要參與者，能夠有效調(diào)控土壤根際環(huán)境和促進(jìn)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響土壤物理結(jié)構(gòu)和土壤肥力[2]。近年來，由于化肥和農(nóng)藥長期過量施用，導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境不斷惡化，致土壤板結(jié)、微生物種群結(jié)構(gòu)趨劣等[3]，從而間接或直接引發(fā)茶樹自身抗逆性降低、病蟲害多發(fā)以及茶葉品質(zhì)下降等一系列問題[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，提高作物生物群落多樣性，可促進(jìn)作物根際土壤有益菌的生長、增強(qiáng)植株自身的抗逆性，從而抑制土傳病害傳播[5]；而季節(jié)[6]、海拔[7]以及種植年限[8-9]等都會影響作物根際土壤微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征。此外，不同品種的同一作物，根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)也會存在一定的差異性。劉鳳紅[10]研究表明，藍(lán)莓根系內(nèi)生真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)因其品種的不同而存在一定差異，且各菌屬在不同品種藍(lán)莓根系內(nèi)的優(yōu)勢度也不同。李強(qiáng)[11]等通過Biolog 方法比較了不同烤煙品種之間根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異，結(jié)果表明，不同品種烤煙根際微生物種類和優(yōu)勢種群數(shù)量并無差異，但微生物種群的分布情況存在顯著差異。目前，有關(guān)不同品種茶樹根際土壤微生物多樣性的研究鮮見報道。本研究通過 Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，對4個茶樹品種的根際土壤真菌多樣性及豐度進(jìn)行比對，旨在明確不同茶樹品種根際土壤的優(yōu)勢菌群及對茶樹的影響，為茶園的生態(tài)管理提供參考與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地為貴州省遵義市道真仡佬族苗族自治縣（107°62′E，28°93′N），位于云貴高原向四川盆地過渡的斜坡地帶，屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫8.0℃～16.4℃、降雨量800～1400 mm、海拔884～939 m、日照時數(shù)1076 h。土樣采集區(qū)茶樹為試驗園長勢相仿的4個茶樹品種：中白1號（BC）、黃金茶（HJC）、黃金芽（HJY）和中茶108（ZC108），樹齡分別為5年、8年、5年、5年，行距均為1.5 m。該地地形屬崗坡地，黏質(zhì)土。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤取樣

土樣采集時間為2018年8月8日，采用五點(diǎn)取樣法用鐵鍬分別采集中白1號、黃金茶、黃金芽、中茶108 的根際土壤，每個品種各取6份，采集土樣混勻后，去除土壤中殘留的根系及其他雜質(zhì)后裝入無菌樣品袋中，低溫保存。

1.2.2 土壤pH值及含水率的測定

土壤pH值與含水率的測定參照張艷艷等[12]的方法，土壤經(jīng)0.165 mm 過篩后，按G 土∶V水=1.0 g ∶2.5 mL 的比例充分混勻后，以pH計測定土壤pH值，重復(fù)3 次。分別稱取10 g土壤于60℃烘箱中進(jìn)行烘干處理，烘干后測定其干重。

1.2.3 土壤真菌總DNA 提取、ITS 基因擴(kuò)增及上機(jī)測序

將每個土樣經(jīng)2 mm 過篩充分混合后，提取基因組DNA，并采用通用引物對 ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS 基因ITS1 區(qū)進(jìn)行測序[13-14]。PCR 擴(kuò)增ITS 特異性片段試驗采用Ta Ka Ra r Taq DNA Polymerase，反應(yīng)體系（20 μL）：10× Buffer 2 μL、2.5 mMdNTPs 2 μL、Forward Primer（5 μM) 0.8 μL、Reverse Primer（5 μM）0.8 μL、r Taq Polymerase 0.2 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA10 ng、ddH2O 13 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min、95℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、25個循環(huán)、72℃延伸10 min、10℃保存∝，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后，上機(jī)檢測（依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05 軟件進(jìn)行差異性分析，差異顯著性檢驗采用Duncan 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤pH值及含水率

結(jié)果表明，4個茶樹品種根際土壤的pH值和含水量無顯著差異（表1）。

2.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 根際土壤稀釋曲線

從圖1 可以看出，樣品稀釋曲線基本上趨于平緩，多樣性指數(shù)表可以看出文庫的覆蓋率（Coverage）達(dá)90%（表2），二者共同說明該土壤樣品OTU 覆蓋度基本飽和，可以反映該區(qū)域真菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。通過高通量測序，4個茶樹品種根際土壤的12個樣品共獲得656918條有效序列，總堿基數(shù)達(dá)153727532 bp，平均長度為234 bp。

表1 不同品種茶樹根際土壤pH值及含水率Table 1 PH value and moisture content of rhizosphere soil of different varieties of tea plant

圖1 不同土壤樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of different each soil samples

2.2.2 茶樹根際真菌的多樣性指數(shù)

Alpha 多樣性指數(shù)一般包括Shannon 豐富度指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、ACE 指數(shù)及Chao1指數(shù)，其中Shannon 豐富度指數(shù)代表群落物種多樣性，Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)代表常見物種，Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)代表群落物種豐富度；數(shù)值越大，說明菌群多樣性或豐度越高。表2結(jié)果表明，除Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)無明顯變化以外，其他指數(shù)均表現(xiàn)為顯著性差異（P＞0.05）。中白1號、黃金芽、黃金茶、中茶108 的根際土壤微生物ACE 指數(shù)分別為241.56、238.55、281.50 和228.00。從Shannon 指數(shù)分析，黃金茶的根際土壤真菌物種豐富度較高（3.22），其次為中茶108（2.54）和中白1號（2.46），黃金芽的根際土壤真菌物種豐富度最低（1.03）。從Chao1 指數(shù)來看，黃金茶顯著高于其他三個品種。以上表明，4個茶樹品種中，黃金茶根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度最高。

2.2.3 茶樹根際真菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性

中白1號、黃金芽、黃金茶和中茶108 等4個茶樹品種根際土壤分別含有6、4、5 和 4個門類的真菌群。4個茶樹品種根際土壤菌群中豐度最高的3 大主要門類相同（圖2），均為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）以及接合菌門（Zygomycota），它們在4個茶樹品種根際土壤中均有分布，但在不同品種茶樹根際土壤所占比例不同。從表3 可以看出，本試驗中的中白1號和黃金茶的根際土壤真菌優(yōu)勢門類為子囊菌門（Ascomycota），分別占總序列的60.31%和70.31%；黃金芽的根際土壤真菌優(yōu)勢門類為擔(dān)子菌門（Basidiomycota），占總序列的86.78 %；中茶108 的根際土壤真菌優(yōu)勢門類為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota），分別占總序列的38.25%、28.73%和26.39%，與其他三個品種茶樹相比，中茶108 的根際土壤中未檢測出羅茲菌門（Rozellomycota）。

由圖2 及表3 對比發(fā)現(xiàn)，4個品種茶樹根際土壤中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐富度為黃金芽＞中茶108 ＞黃金茶＞中白1號，子囊菌門（Ascomycota）的相對豐富度為黃金茶＞中白1號＞中茶108 ＞黃金芽，接合菌門（Zygomycota）的相對豐富度為中白1號＞中茶108 ＞黃金茶＞黃金芽。

表2 不同品種茶樹根際土壤真菌豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)Table 2 Diversity and richness index of the rhizosphere soil fungus of different varieties of tea plant

表3 茶樹根際土壤真菌群落在門水平上的組成和含量（%）Table 3 Composition and content of Fungi community in rhizosphere soil of tea plant at the phylum level（%）

圖2 在門分類水平的茶樹根際土壤真菌組成聚類堆積圖Fig.2 Cluster stacking graph of composition of Fungi in rhizosphere soil of tea plant at phylum level

從屬分類水平來看，中白1號、黃金芽、黃金茶以及中茶108 等4個品種茶樹根際土壤分別含有17、20、19 及17個屬類菌群。柱狀圖（圖3）結(jié)果表明，不同品種茶樹根際土壤真菌群落在屬水平優(yōu)勢物種和相對豐度都有所不同。結(jié)合表4 可以看出，本試驗中黃金芽的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.），其占了總序列的79.82%；中白1號的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.）和被孢霉屬（Mortiellaspp.），分別占了總序列的27.72%和24.02%；黃金茶的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為鐮孢菌屬（Fusarium spp.）和被孢霉屬（Mortiellaspp.），分別占了總序列的18.27%和12.61%；中茶108 的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.）和被孢霉屬（Mortiellaspp.），分別占了總序列的31.39%和24.76%。

從圖3 及表4 可以看出，在屬水平中白1號和中茶108 的根際土壤真菌的相對豐度具有較高的同源性。4個品種茶樹的根際土壤中隱球菌屬（Cryptococcusspp.）的相對豐富度為黃金芽＞中茶108 ＞中白1號＞黃金茶，被孢霉屬（Mortiellaspp.）的相對豐富度為中茶108 ＞中白1號＞黃金茶＞黃金芽，鐮孢菌屬（Fusarium spp.）的相對豐富度為黃金茶＞中白1號＞黃金芽＞中茶108，假霉樣真菌屬（Pseudallescheriaspp.）的相對豐富度為中白1號＞中茶108 ＞黃金芽＞黃金茶。

2.2.4 茶樹根際真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性

圖3 在屬分類水平的茶樹根際土壤真菌組成聚類堆積圖Fig.3 Cluster stacking graph of composition of Fungi in rhizosphere soil of tea plant at genus level

表4 土壤部分真菌群落在屬水平上的組成和含量（%）Table 4 Composition and content of the part of fungus communitiesy in soil at genus level（%）

圖4 不同茶樹根際土壤樣品OTU 分布的Venn 圖Fig.4 Venn diagrams of OTU distribution of the rhizosphere soil samples of different varieties of tea plant

利用Venn 圖對4種茶樹根際土壤樣品的OTU 分布進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。4個品種茶樹的根際土壤樣品中均有分布的OTU 數(shù)量為196，共有OTU 數(shù)量最多的是中白1號和黃金茶（455），最少是黃金芽和中茶108（300）；茶樹根際土壤樣品中共有最多的組合是中白1號、黃金芽和黃金茶（298），說明這3個品種茶樹的根際土壤真菌群落組成具有較高的同源性；4個品種茶樹的根際土壤樣品中獨(dú)有OTU數(shù)從大到小依次為黃金茶（200）、中茶108（187）、中白1號（117）和黃金芽（61）。

從屬水平上對4個品種茶樹的根際土壤樣品所含真菌菌屬進(jìn)行Heatmap 分析，結(jié)果表明，假霉樣真菌屬（Pseudallescheriaspp.）在黃金芽、中茶108 和中白1號的根際土壤真菌群落中豐度較高，而黃金茶根際土壤真菌群落中豐度最高的為鐮孢屬（Fusarum spp.）（圖5）。

圖5 在屬分類水平的茶樹根際土壤樣品OTU 分布的Heatmap 分析Fig.5 Heatmap analysis of OTU Distribution of the rhizosphere soil samples at genus level

3 討論

3.1 不同品種茶樹根際土壤真菌多樣性和豐富度具有一定的差異性

多樣性指數(shù)與微生物群落多樣性呈正相關(guān)，多樣性指數(shù)越高微生物群落多樣性越豐富。試驗結(jié)果表明，不同品種茶樹的根際土壤的OTU數(shù)量和群落多樣性指數(shù)Shannon 都表現(xiàn)為黃金茶＞中茶108 ＞中白1號＞黃金芽，群落豐富度指數(shù)Chao1 和ACE 表現(xiàn)為黃金茶＞中白1號＞黃金芽＞中茶108。結(jié)果表明：①不同品種茶樹的根際土壤真菌群落多樣性和豐富度表現(xiàn)出一定的差異性；②黃金茶根際土壤真菌多樣性最為豐富，但因其種植年限高于其他3個品種，故該品種根際土壤真菌多樣性較豐富的具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同品種茶樹根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異性

本試驗結(jié)果表明，該地區(qū)茶樹根際土壤真菌群落共劃分為4個已知的菌門，其中，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）為優(yōu)勢真菌群，擔(dān)子菌門為第一優(yōu)勢門。從屬的分類水平來看，黃金芽的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.），中白1號根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.）、被孢霉屬（Mortiellaspp.）和假霉樣真菌屬（Pseudallescheriaspp.），黃金茶根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為鐮孢菌屬（Fusariumspp.）和被孢霉屬（Mortiellaspp.），中茶108 的根際土壤真菌優(yōu)勢屬類為隱球菌屬（Cryptococcusspp.）和被孢霉屬（Mortiellaspp.）。結(jié)果表明：①黃金芽的根際土壤優(yōu)勢真菌種類單一，中白1號、黃金茶和中茶108 的根際土壤優(yōu)勢真菌種類較豐富；②大部分土壤真菌都能夠在茶樹根際定殖，但不同品種茶樹根際土壤定殖真菌各有不同，表明茶樹品種對其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。