寧 雪 喬艷紅 姚開(kāi)虎 沈敘莊 劉 鋼

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是引起醫(yī)院相關(guān)性(HA)感染和社區(qū)相關(guān)性(CA)感染的重要病原，可以導(dǎo)致多種類(lèi)型的感染。根據(jù)2017年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的報(bào)告，MRSA分離率占全部金黃色葡萄球菌的35%以上[1]。目前針對(duì)金黃色葡萄球菌流行克隆的報(bào)道，主要基于MLST分型。HA-MRSA流行克?。罕泵朗荢T5克隆，南美是ST239克隆，歐洲是ST36、ST45和ST22克隆，南亞和澳大利亞是ST22克隆，中東和東亞洲地區(qū)是ST239克隆[2]；在中國(guó)大陸地區(qū)成人主要是ST239和ST5克隆[3]。既往本課題組針對(duì)兒童CA-MRSA感染進(jìn)行了研究，但是國(guó)內(nèi)對(duì)兒童HA-MRSA感染的報(bào)告相對(duì)較少。

1 方法

1.1 菌株來(lái)源 2010至2016年從首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)住院患兒的臨床送檢標(biāo)本中分離得到的MRSA連續(xù)菌株。通過(guò)菌落的形態(tài)學(xué)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行初步鑒定，用凝固酶實(shí)驗(yàn)和頭孢西丁紙片(30 μg，Oxoid)法對(duì)菌株進(jìn)行篩查,冷凍狀態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)，以紙片法-20℃儲(chǔ)存。

1.2 菌株納入標(biāo)準(zhǔn) 從我院病歷系統(tǒng)獲得臨床資料，納入符合HA感染定義的病例且MRSA培養(yǎng)陽(yáng)性，留取MRSA分離株；HA感染定義根據(jù)美國(guó)CDC診斷標(biāo)準(zhǔn)，指入院時(shí)不存在，也不處于感染潛伏期，入院≥48 h后發(fā)生的感染。

1.3 DNA提取 按照硅膠模型TM基因組DNA提取試劑盒(北京賽百勝基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明進(jìn)行操作。以提取DNA作為模板，使用PCR方法檢測(cè)菌株的mecA和nuc基因，陽(yáng)性確定為MRSA。

1.4 分子分型

1.4.1 多序列分型(MLST，ST型) PCR檢測(cè)7個(gè)管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil，參考Enright等[4]的引物設(shè)計(jì)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約450 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在MLST數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://saureus.mlst.net)上對(duì)比等位基因序列型(sequence type, ST),從而判斷菌株的ST型，使用eBURSTv3軟件進(jìn)行菌株親緣關(guān)系(clonal complex，CC)分析。

1.4.2 SCCmec分型和亞型 采用文獻(xiàn)[5]中的多重PCR方法進(jìn)行SCCmec分型及亞型的檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物在含1.5%溴乙錠瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存結(jié)果。

1.4.3 spa分型 spa分型的PCR引物參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)spa數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ridom.de/spaserver)進(jìn)行比對(duì)分型。

1.4.4pvl基因檢測(cè) 參照Lina等[7]的引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度433 bp。PCR產(chǎn)物在含溴乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 體外藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂稀釋法檢測(cè)所有菌株對(duì)16種藥物的敏感性，替加環(huán)素、夫西地酸的敏感性依照歐洲抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST)界定。金黃色葡萄球菌ATCC29213為質(zhì)控菌株。MRSA多重耐藥是指對(duì)3種及以上非β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以中位數(shù)表示，中位數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，率的比較采用行×列表分析(卡方檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率檢驗(yàn))。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文菌株納入標(biāo)準(zhǔn)的病例150例，菌株標(biāo)本來(lái)源為呼吸道、膿液、血液、傷口、穿刺液和分泌物。男97例，女53例。年齡5 d至14歲，中位年齡為18個(gè)月，104例(69.3%)年齡<1歲，43例(28.7%)為新生兒。139例(92.7%)以發(fā)熱為首發(fā)癥狀。死亡4例(2.7%)。

2.2 感染類(lèi)型 單部位感染124例(82.7%) ，同時(shí)有2個(gè)及以上部位感染26例；肺炎83例 (55.3%), 皮膚及軟組織感染(SSTIs) 69例 (46.0%), 血流感染21 例(14.0%), 骨髓炎5例(3.3%)，尿路感染1例 (0.7%)。

侵襲性感染52 例(34.7%)，包括肺炎15例, SSTIs 13例, 血流感染2例, 骨髓炎2例，尿路感染1例，肺炎+血流感染7例, SSTIs +血流感染6例, 骨髓炎+血流感染3例, 肺炎+ SSTIs +血流感染3例；非侵襲性感染包括肺炎51例, SSTIs 40例, 肺炎+SSTIs 7例。

2.3 基礎(chǔ)疾病 42例(28%)有基礎(chǔ)疾病，包括癌癥32例, 免疫缺陷疾病5例, Ⅰ型糖尿病3例，先天性心臟病2例。

2.4 治療情況 150例患兒在培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果出來(lái)之前都經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素。頭孢類(lèi)抗生素占90%(135例), 其中一至四代頭孢菌素分別為4、32、72和27例，美羅培南32例，萬(wàn)古霉素6例。16例患兒外用了莫匹羅星軟膏。117例(78%)在血培養(yǎng)陽(yáng)性之后根據(jù)藥敏結(jié)果更換了抗生素，其中83%(97例)更換為萬(wàn)古霉素，12%(14例)更換為利奈唑胺，5.1%(6例)更換為替考拉寧。

2.5 MRSA分離株的分子特征 表1顯示，150株分離株共獲得16種ST分型，分屬于12個(gè)CC。ST分型中，ST239(46%，69株)為最常見(jiàn)克隆，其次是ST59(28%，42株)和ST5(4%，6株)。SCCmec分型中，Ⅲ型(52.7%，79株) 為最常見(jiàn)克隆, 其次是Ⅳ型 (30%，45株) 和 Ⅱ型 (8%，12株)；Ⅳ菌株共有3種亞型，Ⅳa 43株(95.6%), Ⅳb和Ⅳc 各1株。共獲得32個(gè)spa型，t030 (33個(gè), 22.0%)最常見(jiàn)，其次是 t437 (35個(gè), 23.4%)和t037 (19個(gè), 12.7%) 。

最常見(jiàn)的分子分型是ST239-SCCmecⅢ-t030 (34/65, 55.4%), 其次是ST59-SCCmecⅣa-t437 (27/42, 64.3%)。34株分離株 (22.7%)pvl陽(yáng)性。MRSA ST239和ST59 的pvl攜帶率分別為14.5% (10/69) 和40.5% (17/42)。最常見(jiàn)的攜帶pvl的克隆型是ST59-SCCmecⅣa-t437 (13/34, 38.2%)。

2.6 抗生素敏感性 150株菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和替吉環(huán)素敏感。對(duì)其他多種抗生素的耐藥率情況見(jiàn)表2。ST239 與ST59對(duì)慶大霉素[84.1%(58/69)vs19.0%(8/42)] 、四環(huán)素[94.2%(65/69)vs45.2%(19/42)]、利福平[88.4%(61/69)vs9.5%(4/42)]和環(huán)丙沙星[94.2%(65/69)vs21.4%(9/42)]耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。所有菌株、MRSA-ST59 和MRSA-ST239分離株的多重耐藥率分別為84.0%、78.6% 和81.2%。不同的ST型分離株有不同的耐藥譜，72.5% (50/69) 的MRSA-ST239分離株表現(xiàn)為兩種形式的耐藥，包括青霉素-頭孢呋辛-慶大霉素-四環(huán)素-利福平-紅霉素-克林霉素-環(huán)丙沙星 (36/69,52.2%)和青霉素-頭孢呋辛-慶大霉素-四環(huán)素-利福平 (13/69,18.8%)，23.8%(10/42)的MRSA-ST59的耐藥表型為青霉素-頭孢呋辛-四環(huán)素-紅霉素-克林霉素。

表1 HA-MRSA分離株的分子分型 (%)

注 NT：無(wú)法分型

表2 HA-MRSA分離株耐藥情況(n)

注 PEN: 青霉素; CEF: 頭孢呋辛; GEN: 慶大霉素; CHL: 氯霉素; TET: 四環(huán)素; RIF:利福平; ERY: 紅霉素; CLI:克林霉素; AZI: 阿奇霉素; CIP: 環(huán)丙沙星; FUS: 夫西地酸; MUP: 莫匹羅星；VAN: 萬(wàn)古霉素；LIN： 利奈唑胺； TIG: 替吉環(huán)素； 1) MRSA-ST239與ST59 比較P<0.01

3 討論

MRSA是一種傳播范圍廣、致病力強(qiáng)的病原體，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，常與高致病率和病死率相關(guān)，根據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道，MRSA感染占革蘭陽(yáng)性球菌感染的30%～50%[1]。本研究中，MRSA感染以嬰幼兒為主，1歲以下嬰兒占69.3%，國(guó)外一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，<19歲人群中金黃色葡萄球菌的感染在0～4歲兒童中發(fā)生率最高[8]，這可能與該年齡段患兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、抵抗力低有關(guān)。同時(shí)，院內(nèi)MRSA感染疾病類(lèi)型多達(dá)10種，提示院內(nèi)MRSA感染臨床表現(xiàn)多樣。

MRSA院內(nèi)感染流行克隆具有地域性分布，主要的流行克隆包括巴西克隆、匈牙利克隆、紐約/日本克隆、英國(guó)的EMRSA-16和EMRSA-15[9]。在亞洲地區(qū)，最常見(jiàn)的HA-MRSA是巴西型 (ST239-Ⅲ) 和紐約/日本型 (ST5-Ⅱ)[10]。中國(guó)成人常見(jiàn)院內(nèi)感染克隆屬于ST239和ST5[11，12]。在本研究中，兒童HA-MRSA最常見(jiàn)的克隆也是 ST239-Ⅲ, 與中國(guó)成人分布一致，但是本文ST59占28%， 而ST5-Ⅱ僅占5.3%。

近年來(lái)，也有報(bào)道稱(chēng)具有CA特征的MRSA在醫(yī)院內(nèi)出現(xiàn)，成為引起HA感染或?qū)е略簝?nèi)爆發(fā)的克隆型[13]。USA 300是美國(guó)最常見(jiàn)的CA感染的流行克隆，近來(lái)數(shù)次在HA感染中被發(fā)現(xiàn)。在韓國(guó)，有24%的HA感染由常見(jiàn)的社區(qū)MRSA流行克隆ST72-Ⅳ引起[14]。在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)，ST59-Ⅳ和ST59-Ⅴ被報(bào)道出現(xiàn)在HA感染中，并且引起約25%的血流感染[15]。在我國(guó)成人的研究中，社區(qū)常見(jiàn)克隆ST59尚沒(méi)有大范圍出現(xiàn)在HA感染中。本研究中，38.6%的病例是由ST59-Ⅳ/Ⅴ、ST88-Ⅳ、ST25-Ⅳ和ST72-Ⅳ等克隆型的MRSA引起，而這些克隆曾被報(bào)道分別是中國(guó)、南非洲地區(qū)、阿爾及利亞和韓國(guó)的主要社區(qū)流行克隆[16]。其中，ST59-Ⅳ/Ⅴ是我國(guó)兒童最常見(jiàn)的CA感染的流行克隆。CA-MRSA可以感染既往健康的人群，具有CA特征的MRSA逐漸在醫(yī)院中出現(xiàn)，為HA感染的預(yù)防和控制帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，同時(shí)，暴露于院內(nèi)的環(huán)境，抗生素的選擇壓力可能會(huì)導(dǎo)致CA來(lái)源菌株的耐藥性增強(qiáng)，從而使得這些菌株同時(shí)具有強(qiáng)致病性和耐藥性。

本研究中HA-MRSA分離株的pvl攜帶率為22.7%，高于來(lái)自澳大利亞成人(0.7%)和亞洲成人(13.2%)的報(bào)道[17,18]。CA特征的MRSA在院內(nèi)蔓延，也增加了院內(nèi)分離株的菌株毒力，具有CA分子特征的菌株可能在院內(nèi)爆發(fā)流行或更廣的傳播。HA-MRSA公認(rèn)的多重耐藥菌之一，可能與其長(zhǎng)期在院內(nèi)流行承受的抗生素選擇壓力有關(guān)，在本研究中，菌株的多重耐藥率達(dá)70%以上，且不同克隆型的抗生素耐藥性也存在差異，其中ST239分離株對(duì)四環(huán)素、利福平、環(huán)丙沙星和慶大霉素的耐藥率顯著高于ST59分離株。MRSA高耐藥性給臨床用藥選擇帶來(lái)了挑戰(zhàn)，且目前已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)一線藥物萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA，也提醒臨床醫(yī)師更加慎重和規(guī)范地選擇抗菌藥物，以提高治愈率、減少耐藥菌的產(chǎn)生。

綜上所述，醫(yī)院相關(guān)性MRSA感染以低年齡組患兒常見(jiàn)，感染的疾病類(lèi)型多、臨床表現(xiàn)復(fù)雜。本研究中MRSA-ST239-Ⅲ-t030是最常見(jiàn)的流行克隆，其次是MRSA-ST59-Ⅳ-t427，菌株的超抗原基因攜帶率高，耐藥率高，因此應(yīng)該有更有效的措施控制MRSA感染的發(fā)生和抗生素的合理使用。