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(陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東陽江 529566)

致病性微生物引起的食源性疾病,已成為當(dāng)今主要的食品安全問題及世界上最廣泛的衛(wèi)生問題。其中,最主要的是由細(xì)菌引發(fā)的,常見的致病菌包括沙門氏菌、致病性大腸埃希菌、葡萄球菌、致病性鏈球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、志賀菌及其他菌屬等[1]。另外,空調(diào)系統(tǒng)及其他密閉空間的病原菌(如各類芽孢桿菌、霉菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒等)也直接危害人類身體健康[2-3]。因此,具有廣譜殺菌效應(yīng)且性能優(yōu)異的抗菌技術(shù)及材料備受關(guān)注。

目前,常見的抗菌劑主要包括無機(jī)和有機(jī)兩大類。其中,無機(jī)類抗菌劑主要以銀為主,但其在殺滅細(xì)菌同時(shí)釋放出內(nèi)毒素,且難以實(shí)現(xiàn)銀離子的可控緩釋操作[4];有機(jī)類抗菌劑主要以醛類、醇類、酚類、雙胍類、碘伏類及表面活性劑為主,但其本身多具有毒性,不利于食品安全,且易產(chǎn)生微生物抗藥性[5]。鑒于此,近年有學(xué)者致力于抗菌新技術(shù)及材料的研究,如等離子體滅菌、高壓靜電水處理法及光催化技術(shù)等[6]。而自Tadashi等[7]首次發(fā)現(xiàn)光催化劑TiO2受紫外光激發(fā)具有殺菌效果后,因納米TiO2光催化抗菌劑具有廣譜殺菌性、無毒無害、不產(chǎn)生二次污染及微生物耐藥性等優(yōu)勢,其光催化殺菌性能備受國內(nèi)外學(xué)者青睞[8-9]。Huang等[10]用TiO2結(jié)合紫外作用于大腸桿菌,使其細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)成分相繼發(fā)生變化最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;Sunada等[11]、曾熾濤等[12]先后成功地應(yīng)用TiO2光催化氧化法去除飲用水中的大腸桿菌;田莉瑛等[13]發(fā)現(xiàn)TiO2對(duì)金黃色葡萄球菌及荀酵母菌均具有較好的殺菌性能;李君建等[14]采用負(fù)載型TiO2對(duì)枯草芽孢桿菌及大腸桿菌進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn),抑菌圈直徑可達(dá)25.8 mm;黃利強(qiáng)等[15]把納米TiO2應(yīng)用于嗜水氣單胞菌及鰻弧菌的處理,殺菌率可達(dá)98%以上;另外,TiO2光催化殺滅的微生物還包括多種噬菌體、真菌及藻類等[16]。而納米TiO2的光催化性能與其晶體結(jié)構(gòu)、比表面積等因子密切相關(guān),但國內(nèi)對(duì)其結(jié)構(gòu)及催化殺菌性能二者的關(guān)系鮮有報(bào)道。

因此,本文利用制備方法簡單且均勻性較高的溶膠凝膠法[17]合成納米級(jí)TiO2光催化劑,并分別選用革蘭氏陰性菌大腸桿菌及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為靶向污染物,探討TiO2的晶體結(jié)構(gòu)及光催化滅菌性能,為其在食品衛(wèi)生領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煌綠乳糖膽鹽肉湯、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;大腸桿菌(菌號(hào)GIM 1.355)、金黃色葡萄球菌(菌號(hào)GIM 1.221) 廣東省微生物菌種保藏中心;鈉鹽 廣東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司;無水乙醇、硝酸、冰乙酸等試劑 均為分析純;鈦酸丁酯 化學(xué)純;實(shí)驗(yàn)用水 為新鮮超純水。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;JB-3型恒溫定時(shí)磁力攪拌器 上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司;Lx-B75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;SX2-4-10Q型馬弗爐 武漢江宇電爐制造有限公司;THZ-82A型恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器廠;SWCJ-2型超凈工作臺(tái) 上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司;LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;TriStarⅡ3020型全自動(dòng)比表面積及孔隙分析儀 美國麥克公司;D/max-ⅢA型X射線衍射儀 日本理學(xué)公司;VG Multilab 2000型X-射線光電子能譜儀 美國熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TiO2納米光催化劑的制備 以鈦酸丁酯(C16H36O4Ti)為前驅(qū)物,利用溶膠凝膠法[17]制備納米級(jí)光催化劑TiO2,具體制備過程如下:將10 mL C16H36O4Ti和30 mL無水乙醇攪拌混合。另量取50 mL乙醇、3 mL水和1.5 mL硝酸混合,在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加到前面所述溶液中,得到淡黃色溶膠,并充分?jǐn)嚢?2 h,靜置,凝膠陳化。待室溫陳化24 h后,80 ℃水浴加熱,使溶劑揮發(fā),干燥后球磨2 h成粉末。將上述所得粉末于程序升溫馬弗爐中(N2氣氛保護(hù))450 ℃下焙燒2 h,焙燒后再次研磨,得到納米TiO2光催化劑,備用。

1.2.2 TiO2納米光催化劑的表征

1.2.2.1 BET測試 BET(比表面積)測試是以氮?dú)鉃榉治鰵怏w并測定飽和壓力,在液氮恒溫(溫度77K)下測定不同吸附壓力下的吸附體積(測定前樣品先在573 K溫度下脫氣3 h),通過BET(Barrett-Emmett-Tellter)方程式計(jì)算樣品比表面積。

1.2.2.2 XRD測試 XRD(X射線衍射)分析的測試條件為:室溫,Cu Kα源,Cu靶激發(fā)的Kα輻射為射線源,管電壓為30 kV,管電流為30 mA,掃描角度范圍為10～60°(2θ),掃描速度為4 °/min。根據(jù)Scherrer公式:d=0.89λ/(βcosθ)計(jì)算出粉末樣品中晶粒的平均粒徑,其中β是該物相中最強(qiáng)衍射峰的半峰高寬,λ是X射線的波長,θ為衍射角。

1.2.2.3 XPS測試 XPS(X光電子能譜)分析檢測催化劑表面的元素成分及價(jià)態(tài)。主要分析參數(shù):能量分辨率:0.48 eV,成像空間分辨率:3 μm,最小分析區(qū)域:15 μm,測試條件Mg Ka(hv=1253.6 eV)射線,全譜(0～1000 eV),C 1s校準(zhǔn)結(jié)合能284.6 eV。

1.2.3 TiO2納米光催化劑的殺菌性能評(píng)價(jià)

1.2.3.1 細(xì)菌懸液的制備 根據(jù)無菌操作要求,于超凈工作臺(tái)中分別將大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌種轉(zhuǎn)接到滅菌后的培養(yǎng)基上,并置于生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,使其活化。再將活化后的菌種接種到LB肉湯培養(yǎng)基內(nèi),并進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)以使細(xì)菌達(dá)到指數(shù)生長期。對(duì)初步制成的細(xì)菌懸液,用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至1.0×105～1.0×106cfu/mL(以預(yù)計(jì)生長的菌落數(shù)每平板30～300 cfu為宜),備用。

1.2.3.2 紫外結(jié)合TiO2光催化劑對(duì)殺菌率的影響 稱取0.01 g納米TiO2樣品,加入上述備用的細(xì)菌懸液100 mL中。利用涂布法[12]再將菌液加入一系列LB平板培養(yǎng)基,在波長為254 nm,功率為16 W的紫外燈照射條件下,進(jìn)行光催化反應(yīng),反應(yīng)30 min后,將平板置于生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)并計(jì)算菌落數(shù),采用平板菌落計(jì)數(shù)法[18]考察紫外結(jié)合TiO2光催化劑對(duì)革蘭氏陰性代表菌大腸桿菌(G-)及陽性代表菌金黃色葡萄球菌(G+)作用30 min后的殺菌性能。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(不加納米TiO2,同時(shí)無紫外光照射)及對(duì)照組(只加TiO2或只加紫外光照射),且為保證數(shù)據(jù)可靠性,每次均做2次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn),并重復(fù)3次取平均值。TiO2納米光催化劑的殺菌率計(jì)算公式為:

殺菌率(%)=(空白組的菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù))/空白組的菌落數(shù)×100

1.2.3.3 作用時(shí)間對(duì)殺菌率的影響 在波長為254 nm,功率為16 W的紫外光照射條件下,按照1.2.3.2中所述光催化反應(yīng)過程,分別考察在作用時(shí)間為10、20、30、40、50及60 min時(shí),TiO2納米光催化劑(濃度為0.1 g/L)對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌性能。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(不加納米TiO2,同時(shí)無紫外光照射),按照TiO2納米光催化劑的殺菌率計(jì)算公式計(jì)算殺菌率。

1.2.3.4 TiO2濃度對(duì)殺菌率的影響 在波長為254 nm,功率為16 W的紫外光照射條件下,分別考察不同濃度0.01、0.1及1.0 g/L的TiO2納米光催化劑對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作用30 min后的殺菌性能。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(不加納米TiO2,同時(shí)無紫外光照射),按照TiO2納米光催化劑的殺菌率計(jì)算公式計(jì)算殺菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0分析殺菌率與納米光催化劑TiO2之間的相互關(guān)系及殺菌率之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TiO2納米光催化劑的表征分析

2.1.1 BET分析 通過BET比表面積測試,得到上述溶膠凝膠法制備的納米光催化劑TiO2比表面積為76.5 m2/g,與氣相法制備的P25型商業(yè)級(jí)TiO2(比表面積為(50±15) m2/g)[19]相比具有較大的比表面積,而適當(dāng)增大催化劑的比表面積有利于提高其催化活性[17]。

2.1.2 XRD分析 圖1為TiO2經(jīng)450 ℃焙燒2 h后的XRD譜圖。圖中2θ=25.32 °(101)、38.12 °(004)、48.06 °(200)和54.28 °(105)處出現(xiàn)的均是TiO2的銳鈦礦晶型特征峰[20],2θ=25.32 °處出現(xiàn)最強(qiáng)衍射峰。而在2θ=27.48 °(110)、36.12 °(101)和41.26 °(111)處出現(xiàn)了較為明顯的金紅石晶型特征峰[20],說明樣品中存在少量的金紅石相。由圖1可知,TiO2為以銳鈦礦相為主的銳鈦礦與金紅石混晶結(jié)構(gòu)。根據(jù)相關(guān)研究[21-23],一般認(rèn)為銳鈦礦型TiO2的光催化活性比金紅石型的好,而具有銳鈦礦與金紅石混晶結(jié)構(gòu)的TiO2的催化效果則優(yōu)于任何一種單一晶型的催化效果。另外,利用Scherrer公式D=0.89λ/(βcosθ),計(jì)算得到該樣品中TiO2的平均粒徑為16.9 nm。

圖1 樣品TiO2的XRD衍射圖Fig.1 XRD pattern of sample TiO2

2.1.3 XPS分析 通過對(duì)TiO2納米粒子進(jìn)行X射線光電子能譜(XPS)分析,其表面元素含量結(jié)果見圖2。從TiO2的XPS全譜分析圖可以看出，在TiO2中主要成分為Ti、O兩種元素,二者的原子濃度分別為18.75%、48.56%,接近1∶2.6,之所以沒有達(dá)到理論值1∶2,主要是由于除了TiO2晶體含有氧元素,TiO2納米粒子表面還可能吸附其它含氧物質(zhì),如氧氣和水等。另外,還含有一定量的C元素,含量為32.69%,可能是在測試過程中或儀器本身的有機(jī)污染引入的。另外,通過分析純TiO2中O 1s的高倍XPS數(shù)據(jù),在結(jié)合能為530.6、532.2及534.2 eV處分別出現(xiàn)了TiOx、-OH及COO-特征峰[24]。

圖2 TiO2樣品XPS全譜圖Fig.2 XPS spectrum of sample TiO2

圖3是純TiO2納米粒子Ti 2p高分辨XPS譜圖。由圖3可知,因電子的自旋-軌道耦合,Ti 2p能級(jí)分裂為兩個(gè)能級(jí)Ti 2p1/2和Ti 2p3/2,譜線亦基本呈Gaussian對(duì)稱曲線分布。Ti 2p3/2的電子結(jié)合能為459.5 eV,而Ti 2p1/2的電子結(jié)合能約為465.2 eV,帶間的能量差約為5.7 eV,與文獻(xiàn)報(bào)道比較吻合[24],說明Ti處于Ti4+的結(jié)合態(tài),由此可見制備的TiO2純度較高。在單質(zhì)Ti中,Ti 2p3/2的電子結(jié)合能為453.8 eV,Ti 2p1/2的電子結(jié)合能為459.9 eV,帶間能量差為6.1 eV,與單質(zhì)相比,Ti 2p3/2有5.7 eV的化學(xué)位移,是由于Ti所處的周圍化學(xué)環(huán)境不同而造成的。

圖3 TiO2樣品Ti 2p高分辨XPS譜圖Fig.3 Ti 2p high-resolution XPS spectrum of sample TiO2

2.2 TiO2納米光催化劑的殺菌性能評(píng)價(jià)

2.2.1 紫外結(jié)合TiO2光催化劑對(duì)殺菌率的影響 紫外結(jié)合TiO2光催化劑對(duì)革蘭氏陰性代表菌大腸桿菌G-及陽性代表菌金黃色葡萄球菌G+作用30 min后的殺菌性能如圖4所示。從圖4中可知,TiO2納米光催化劑在無紫外光照射條件下幾乎不存在催化殺菌性能,對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行單獨(dú)紫外照射,殺菌效率分別為91.3%及94.7%,而在存在TiO2納米光催化劑且紫外光照射條件下的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率分別提高至97.8%及99.4%。表明TiO2與紫外光照可相互作用,其在紫外光照激發(fā)下產(chǎn)生電子-空穴(e--h+)對(duì),而電子-空穴對(duì)具有氧化作用,可直接與細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及其他成分反應(yīng),引起細(xì)菌功能失活及滅亡[13]。另外,根據(jù)XPS分析,實(shí)驗(yàn)制備的TiO2樣品中亦存在-OH自由基,其反應(yīng)能高達(dá)402.8 MJ/mol[25],可有效分解細(xì)菌有機(jī)組分從而達(dá)到滅菌效果。

圖4 紫外光照條件對(duì)殺菌率的影響Fig.4 Effects of irradiation UV light on sterilizing rate

2.2.2 作用時(shí)間對(duì)殺菌率的影響 紫外光照射條件下,考察0.1 g/L的TiO2納米光催化劑對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作用不同時(shí)間的殺菌性能,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,TiO2對(duì)兩種細(xì)菌的殺滅效果可分為三個(gè)階段:當(dāng)TiO2作用時(shí)間在20 min以內(nèi)時(shí),TiO2對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的光催化殺菌率快速上升至90%以上;當(dāng)TiO2作用時(shí)間在20～40 min時(shí),TiO2光催化殺菌率緩慢上升,作用40 min時(shí)對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率分別為99.2%及100%;40 min后TiO2對(duì)兩種細(xì)菌的光催化殺菌率均趨于穩(wěn)定在100%。而單獨(dú)紫外照射條件下,作用30 min后對(duì)兩種細(xì)菌的殺菌率才升至90%以上,作用50 min后漸趨于100%。根據(jù)XRD分析,實(shí)驗(yàn)制備的TiO2納米光催化劑粒徑為16.9 nm,該超微細(xì)小顆?？杀痪w表面快速、完全吸附,當(dāng)進(jìn)行紫外光照射時(shí),TiO2納米粒子即產(chǎn)生光催化活性,產(chǎn)生的電子-空穴對(duì)及-OH自由基等穿透并氧化破壞細(xì)菌細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu),從而在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好的滅菌效果。

圖5 作用時(shí)間對(duì)殺菌率的影響Fig.5 Effects of photocatalytic time on sterilizing rate

2.2.3 TiO2濃度對(duì)殺菌率的影響 不同濃度TiO2納米光催化劑對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌性能結(jié)果如圖6所示。TiO2納米光催化劑對(duì)兩種細(xì)菌的殺菌率均隨TiO2濃度的增大而提高,當(dāng)TiO2濃度為0.01 g/L時(shí),其對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率分別為56.3%及67.9%,表明TiO2濃度過低時(shí),經(jīng)紫外光照激發(fā)產(chǎn)生的電子-空穴對(duì)及-OH自由基等活性位點(diǎn)較少,且未能被有效利用,故殺菌率較低;而當(dāng)TiO2濃度從0.01 g/L增大至0.1 g/L時(shí),殺菌率與TiO2濃度成顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.05);繼續(xù)增大TiO2濃度至1.0 g/L時(shí),其對(duì)兩種代表菌的殺菌率則分別較濃度為0.1 g/L時(shí)提高0.8%及0.2%,可見TiO2濃度過高時(shí)易使溶液渾濁度增大,影響透光率,因此高濃度TiO2條件下,殺菌率與TiO2濃度之間無顯著差異性(p>0.05)。

圖6 TiO2濃度對(duì)殺菌率的影響Fig.6 Effects of TiO2 concentration on sterilizing rate

3 結(jié)論

采用溶膠-凝膠法制備的半導(dǎo)體光催化劑TiO2在450 ℃下煅燒,可獲得以銳鈦礦相為主的銳鈦礦與金紅石混晶結(jié)構(gòu)的納米粒徑顆粒,其在紫外光激發(fā)下具有較好的光催化作用。在紫外光照條件下,添加濃度為0.1 g/L的TiO2作用30 min后,對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率可分別高達(dá)97.8%及99.4%,并在作用40 min后均可穩(wěn)定在100%。該納米光催化劑無毒,不產(chǎn)生二次污染,對(duì)革蘭氏陰性代表菌及革蘭氏陽性代表菌均具有良好的殺菌效果,有利于該技術(shù)在食品衛(wèi)生領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。