郭云翮

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科教研室，山西大同037009)

有研究表明，免疫細(xì)胞和神經(jīng)元相互作用介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)病理性疼痛中起重要作用[1]。在創(chuàng)傷及炎癥模型中，外周神經(jīng)中發(fā)揮作用的免疫細(xì)胞是中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞可直接調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1(IL-1)等細(xì)胞因子，從而參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展[2]。以往研究證實(shí)，米諾環(huán)素(MI)可抑制神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型的發(fā)展[3]。因而，本研究目的是評(píng)價(jià)MI對(duì)慢性壓迫性損傷(CCI)大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型及小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，體重180～200 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將SD大鼠隨機(jī)分成：Sham+vehicle、CCI+vehicle和CCI+MI組。MI(10、20和40 mg/kg)溶于生理鹽水中，在大鼠CCI手術(shù)前1h腹腔膜注射，持續(xù)到CCI手術(shù)后14 d(1次/d)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 MI和丙酮(美國(guó)Sigma公司)；ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CCI模型制備 10%水合氯醛麻醉(150～200 mg/kg)大鼠，在股骨下方約1 cm切開皮膚，然后鈍性分離肌肉，在坐骨神經(jīng)分成三支前主干部位游離神經(jīng)7 mm左右，在距神經(jīng)起始處上方2 mm，用線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道。Sham組除結(jié)扎坐骨神經(jīng)，其余程序同CCI組。

1.2.2 機(jī)械性刺激痛 CCI模型制備前及制備后1、3、5、7、10和14 d對(duì)大鼠進(jìn)行縮足閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)測(cè)定。主要采用vonFrey細(xì)絲法，vonFrey細(xì)絲(1.0～15 g)垂直刺激大鼠后足中央處，持續(xù)5～10 s，出現(xiàn)明顯縮足、舔足及抬足行為為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.3 冷刺激誘發(fā)痛 將丙酮涂到大鼠后足心，每只大鼠雙側(cè)后足均檢測(cè)5次，每次間隔時(shí)間為1 min，按照下面的公式計(jì)算縮足的頻率=縮足次數(shù)/5×100%。

1.2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞分離 水合氯醛麻醉大鼠，取出脊髓腰膨大部分，用剪刀剪碎，然后加入胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液加入新試管中，吸管吹打，用篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，加入DEEM培養(yǎng)基，上述混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后純化小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.5 ELISA分析 對(duì)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，通過ELISA試劑盒規(guī)定的步驟檢測(cè)細(xì)胞中IL-1濃度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械性痛覺增敏

與CCI手術(shù)前比較，CCI手術(shù)后3 d大鼠出現(xiàn)很強(qiáng)的痛覺增敏(P<0.01)，這種效應(yīng)持續(xù)到研究結(jié)束(P<0.001)。Sham組大鼠沒有表現(xiàn)出機(jī)械性痛覺增敏。與CCI手術(shù)前比較，CCI+MI(10、20和40 mg/kg)大鼠也無(wú)明顯機(jī)械性痛覺增敏發(fā)生(見圖1)。

圖1 VonFrey法檢測(cè)大鼠縮足閾值(PWT)

2.2 冷刺激反應(yīng)

與CCI手術(shù)前比較，CCI手術(shù)后3 d大鼠出現(xiàn)疼痛行為(P<0.01)，這種效應(yīng)在研究期間一直存在(P<0.001)。Sham組大鼠沒有表現(xiàn)出疼痛行為。與CCI手術(shù)前大鼠比較，CCI+MI(10、20和40 mg/kg)大鼠也無(wú)顯著疼痛行為產(chǎn)生(見圖2)。

圖2 丙酮法檢測(cè)大鼠縮足頻率

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1濃度

2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1濃度

ELISA分析結(jié)果顯示，與CCI組大鼠比較，MI處理(20和40 mg/kg)CCI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1濃度明顯降低(P<0.05)；然而MI處理(10 mg/kg)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1濃度未降低(見圖3)。

3 討論

本研究主要評(píng)估MI在CCI誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的鎮(zhèn)痛作用，并檢測(cè)分離小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1水平。炎性細(xì)胞因子在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中起重要作用。其中受傷部位以及脊髓膠質(zhì)細(xì)胞均可以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性介質(zhì)也是由小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的[3]。其中細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1，是由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，參與神經(jīng)元損傷，并引起免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]。神經(jīng)損傷和/或炎癥后，膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎性細(xì)胞因子和其他介質(zhì)促進(jìn)疼痛傳導(dǎo)。小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑在減少疼痛傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要的作用[5]。目前有研究已經(jīng)試圖合成抑制促炎性細(xì)胞因子物質(zhì)。據(jù)研究報(bào)道，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物可以減少細(xì)胞因子釋放[6]。抑制不同免疫細(xì)胞來(lái)源炎性細(xì)胞因子可以預(yù)防神經(jīng)損傷后神經(jīng)性痛。外周神經(jīng)損傷后脊髓IL-1增加可能參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展。坐骨神經(jīng)損傷誘導(dǎo)病變區(qū)域IL-1及其受體上調(diào)。上述結(jié)果提示，IL-1與神經(jīng)損傷和疼痛相關(guān)，而且在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中起重要作用[7]。

本研究結(jié)果表明，MI(10、20和40 mg/kg)可緩解CCI誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛，并且降低培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1。Amin等[8]人研究指出，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β在CCI建立后第3、7和14天表達(dá)均增高；而連續(xù)7 d腹腔內(nèi)注射MI(50 mg/kg)可有效降低CCI后第3天和第7天TNF-α、IL-1β的表達(dá)。我們的研究結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，MI可緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，MI作為小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，可以通過減少CCI誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，并降低參與神經(jīng)病理性疼痛的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。