王曉寧，梁歡，王帥，方文生，許景升，馮潔，徐進(jìn)，曹坳程

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青枯菌銅抗性基因的功能

王曉寧，梁歡，王帥，方文生，許景升，馮潔，徐進(jìn)，曹坳程

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】植物細(xì)菌性青枯?。╞acterial wilt of plants）是由茄科雷爾氏菌（）引起的一種世界性重大土傳病害。作為防治青枯病等細(xì)菌性病害的重要?dú)⒕鷦~制劑的廣泛使用造成多種植物病原細(xì)菌群體中出現(xiàn)了銅抗性菌株。青枯菌Po82菌株大質(zhì)粒上攜帶了丁香假單胞菌中的銅抗性編碼基因的同源物，論文旨在探明青枯菌Po82菌株在銅抗性、致病性等方面的生物學(xué)功能?！痉椒ā恳郧嗫菥鶳o82菌株為研究對(duì)象，利用MEGA6.0軟件包，基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探究銅抗性基因在青枯菌和其他植物病原細(xì)菌中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)反向遺傳學(xué)的研究手段，采用基因同源重組雙交換和電擊轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建基因缺失菌株及相應(yīng)互補(bǔ)菌株。通過(guò)最小抑制濃度（minimal inhibition concentration，MIC）測(cè)定、RT-qPCR、Biolog代謝芯片以及致病力等基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定研究手段，解析與青枯菌銅脅迫應(yīng)答、代謝活性、致病性和運(yùn)動(dòng)性等表型生物學(xué)特征之間的關(guān)系。【結(jié)果】同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，廣泛存在于青枯菌群體中，青枯菌在親緣關(guān)系上與耐金屬貪銅菌最為緊密, 與稻黃單胞菌、丁香假單胞菌和大腸桿菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。RT-qPCR結(jié)果顯示的表達(dá)受到銅離子的誘導(dǎo)，的表達(dá)量隨著CuSO4濃度的增加而增加。CuSO4濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)，基因表達(dá)量最高。銅MIC測(cè)定結(jié)果顯示基因缺失菌株對(duì)銅離子的敏感性增加，基因缺失菌株的MIC值為0.8 mmol·L-1，較野生型菌株的1.2 mmol·L-1下降了33.3%，互補(bǔ)菌株恢復(fù)了銅抗性能力，表明在青枯菌的銅脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。與野生型菌株相比，基因缺失菌株在普通NA培養(yǎng)基及含0.6 mmol·L-1CuSO4的NA培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率降低，表明與青枯菌的生長(zhǎng)速率相關(guān)?；蛉笔Ь暧诎l(fā)病前期病情指數(shù)較野生型菌株下降，接種第10天，基因缺失菌株的病情指數(shù)較Po82野生型菌株下降了11.7%。的缺失導(dǎo)致青枯菌對(duì)-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源，L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代謝利用速率降低，使青枯病發(fā)病病程延長(zhǎng)。與野生型菌株P(guān)o82相比，基因缺失菌株中III型分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因和，III型效應(yīng)子RipX編碼基因的表達(dá)量顯著下調(diào)?！窘Y(jié)論】銅抗性基因在青枯菌銅脅迫應(yīng)答、致病性等方面發(fā)揮一定的作用，研究結(jié)果可為進(jìn)一步解析青枯菌的銅抗性分子機(jī)制以及銅抗性菌株的防治提供理論依據(jù)。

青枯菌；銅抗性；; 致病性

0 引言

【研究意義】由茄科雷爾氏菌（）引起的植物細(xì)菌性青枯?。╞acterial wilt of plants）是一種世界性重大病害[1-2]。由于廣闊的地理分布和廣泛的生態(tài)與寄主適應(yīng)性，青枯菌可侵染54科450余種植物[3]，造成產(chǎn)量損失15%—95%，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要限制因子[4-5]。銅是生物有機(jī)體必備的微量元素，在電子傳遞鏈中可以作為電子供體和受體。同時(shí)在微生物體內(nèi)，銅是許多酶和蛋白的重要組分，在許多重要的氧化和還原過(guò)程中發(fā)揮作用[6-7]。然而，銅的過(guò)量積累會(huì)促進(jìn)羥基自由基的產(chǎn)生，從而造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[8]。因此銅制劑作為抗菌劑在防治細(xì)菌性病害中起著重要作用。含銅殺菌劑廣泛使用造成的持續(xù)選擇壓力，致使包括腸桿菌屬（Enterobacter、Hormaeche和Edwards）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和黃單胞菌屬（Xanthomonas）等多個(gè)種的細(xì)菌群體中出現(xiàn)了銅抗性或耐受性菌株[8-10]。因此，解析青枯菌銅抗性的分子機(jī)制有助于青枯菌銅抗性菌株的防治?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物病原細(xì)菌中，第一個(gè)闡述較為清晰的銅抗性編碼系統(tǒng)是丁香假單胞菌（pv.）中的基因簇，是雙組分調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。丁香假單胞菌采用累積隔離的策略來(lái)應(yīng)對(duì)銅脅迫，周質(zhì)蛋白CopA可結(jié)合10.9±1.2銅原子，周質(zhì)蛋白CopC可結(jié)合0.6±0.1銅原子，CopB為外膜蛋白，CopD為內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6,9,11]。大腸桿菌（）采用外排的作用方式達(dá)到抗銅的目的。大腸桿菌存在兩套銅抗性系統(tǒng)，其中位于染色體上的-和基因賦予大腸桿菌在好氧條件下中等銅濃度的銅耐受性和厭氧條件下的高銅濃度下銅耐受性，位于質(zhì)粒上的基因系統(tǒng)負(fù)責(zé)提供高銅濃度的銅耐受性[12-13]。大腸桿菌CopA蛋白屬于P-型ATP酶，負(fù)責(zé)將過(guò)量的銅從細(xì)胞質(zhì)中輸出到周質(zhì)空間。而CusCFBA編碼蛋白屬于抗性結(jié)節(jié)化家族成員，負(fù)責(zé)將銅從細(xì)胞質(zhì)周圍排出體外[13]。其中CusA、CusB和CusC參與組裝成質(zhì)子動(dòng)力外排泵，將過(guò)多的銅泵出細(xì)胞質(zhì)外。是基因簇的核心蛋白，編碼多銅氧化酶家族蛋白[14]。青枯菌中與的起始密碼子重疊，采用CD-search對(duì)青枯菌Po82菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，結(jié)果表明CopA蛋白屬于CopA銅抗性蛋白家族，具有銅結(jié)合位點(diǎn)和典型的TaT信號(hào)序列（雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑），表明青枯菌銅抗性的機(jī)制為銅轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究中，發(fā)現(xiàn)青枯菌Po82菌株的大質(zhì)粒上攜帶了與丁香假單胞菌銅抗性編碼系統(tǒng)、大腸桿菌抗性編碼系統(tǒng)同源的基因簇[15]。該菌株于含亞抑制銅濃度水平（0.8 mmol·L-1CuSO4）的NA上生長(zhǎng)48 h后，形成了典型的黑色菌落，推測(cè)該菌株可能采用了與丁香假單胞菌相同的應(yīng)對(duì)銅脅迫策略，將銅“隔離/累積”于周質(zhì)空間。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了進(jìn)一步深入解析是否參與Po82菌株的銅抗性，采用反向遺傳學(xué)的研究手段，探明與青枯菌銅抗性、致病性等表型生物學(xué)特征之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究青枯菌寄主及環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)，為青枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年11月至2018年8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 菌株、試劑與儀器

供試菌株：青枯菌2號(hào)小種Po82菌株，由筆者實(shí)驗(yàn)室收集保存；TIANamp Bacteria DNA Kit由天根生化科技有限公司提供，Ex Taq酶由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司提供，Assembly試劑盒由北京中美泰和生物技術(shù)有限公司提供。熒光定量PCR儀為美國(guó)AB公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)為德國(guó)AJ公司產(chǎn)品。

1.2 菌株培養(yǎng)條件

供試菌株材料詳見(jiàn)表1。青枯菌及其基因缺失菌株在NA（nutrient agar）培養(yǎng)基（葡萄糖10 g·L-1，酵母浸粉0.5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，瓊脂18 g·L-1）28℃培養(yǎng)。大腸桿菌在LB培養(yǎng)基（氯化鈉10 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，瓊脂16 g·L-1）37℃培養(yǎng)。所用抗生素濃度：慶大霉素50 μg·mL-1，卡納霉素50 μg·mL-1，氨芐青霉素50 μg·mL-1。

表1 本試驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒

1.3 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得23個(gè)與Po82菌株銅抗性基因同源的基因序列，利用MAGA6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并以的為外組，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自檢重復(fù)值設(shè)置為1 000[16]。

1.4 基因缺失及互補(bǔ)載體構(gòu)建

NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)Po82菌株48—72 h，經(jīng)PCR驗(yàn)證（759f/760r）后，挑取單菌落于NB培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8—1.0，提取基因組DNA（TIANamp Bacteria DNA Kit）。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的Po82全基因組序列（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/CP002820），分別選取上下游各1 000—1 100 bp左右的序列為靶標(biāo)，用Blast和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物copAupf/r和copAdownf/r，利用高保真酶（TakaRa Ex Taq?）擴(kuò)增，使用USER酶將擴(kuò)增的copA上下游片段與經(jīng)PacI酶切的pKMS1-gm質(zhì)粒連接，連接順序?yàn)閁p-gm-Down[17]。敲除載體構(gòu)建后經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

Po82基因組為模板，設(shè)計(jì)引物copA Hf/r擴(kuò)增copA的整個(gè)開(kāi)放閱讀框。設(shè)計(jì)引物PBBRf/r，通過(guò)PCR擴(kuò)增線性化質(zhì)粒pBBR1mcs-4。根據(jù)同源重組雙交換的原理，利用Assembly試劑盒將copA擴(kuò)增基因連接在載體質(zhì)粒上?；パa(bǔ)載體構(gòu)建后，經(jīng)引物copATestf/r擴(kuò)增驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 基因缺失及互補(bǔ)菌株構(gòu)建

采用同源重組雙交換的原理構(gòu)建的缺失菌株[18]。通過(guò)自然轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的敲除載體轉(zhuǎn)化到青枯菌Po82野生型菌株中，篩選出慶大霉素與蔗糖抗性，卡那霉素敏感菌株，分別用759f/760r、copAf/copAr和copAupf/copAdownr進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，測(cè)序驗(yàn)證。采用電轉(zhuǎn)的方法構(gòu)建互補(bǔ)菌株[19]?；パa(bǔ)載體轉(zhuǎn)化到缺失菌株中，篩選出具有氨芐青霉素和慶大霉素抗性的菌株，經(jīng)759f/760r和copAf/r引物PCR驗(yàn)證后，測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 銅抗性最小抑制濃度（minimal inhibition concentration，MIC）測(cè)定

Po82野生型、基因缺失菌株及互補(bǔ)菌株置于NB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.6—0.8），以比濁法稀釋至105cfu/mL，取5mL菌液分別涂在含不同濃度CuSO4的NA培養(yǎng)平板上（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1）。28℃培養(yǎng)48—72 h，以菌落能正常生長(zhǎng)的最大CuSO4濃度作為MIC值，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)[15]。

1.7 基因表達(dá)量測(cè)定

挑取NA固體培養(yǎng)基上的青枯菌單菌落于NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（28℃，180 r/min），當(dāng)菌生長(zhǎng)到OD600為0.3—0.4時(shí)，分別吸取1 mL菌液至NB培養(yǎng)基和含不同濃度CuSO4的NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，盡量使兩份菌液的生長(zhǎng)條件一致。搖菌到OD600為0.8時(shí)，離心收集菌體用于RNA的提取。RNA的提取采用總TRIzol法（Invitrogen，USA）[20]。cDNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒。RT-qPCR采用SYBR Premix Ex TaxⅡ（Takara）試劑盒。熒光定量的儀器為ABI 7500 Real-time Detection System（Applied Biosystems，USA）。PCR反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，設(shè)置40個(gè)循環(huán)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)引物的擴(kuò)增效率，用熔解曲線評(píng)價(jià)引物的特異性。用內(nèi)參基因?qū)NA樣品進(jìn)行均一化（表2）。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用公式為2?ΔΔCt[21]。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將Po82野生型、基因缺失菌株及其相應(yīng)互補(bǔ)菌株在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6—0.8，稀釋到OD600=0.3，按1﹕100的體積比接種到不同濃度的CuSO4培養(yǎng)基中（0、0.6 mmol·L-1）。培養(yǎng)于28℃，180 r/min，每3 h測(cè)定細(xì)胞OD600值，每組重復(fù)3次。

1.9 致病性測(cè)定

采用傷根接種法測(cè)定基因缺失對(duì)青枯菌致病力的影響[22]。用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型菌株及缺失株48—72 h，滅菌水洗脫菌株，用比濁法稀釋到107cfu/mL。番茄感病品種“中雜9號(hào)”生長(zhǎng)至7—8葉齡期時(shí)，在離植株1 cm處的土壤中切下3 cm深的裂口，每棵植株澆注30 mL濃度為107cfu/mL菌液。培養(yǎng)條件為光周期L﹕D=16 h﹕8 h，溫度為32/30℃。每個(gè)菌株接種20株，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。病情指數(shù)分為5級(jí)：0級(jí)=無(wú)癥狀；1級(jí)=1片葉萎蔫；2級(jí)=2—3片葉萎蔫；3級(jí)=4片及以上葉片萎蔫；4級(jí)=整株葉片萎蔫[23]。

1.10 代謝活性測(cè)定

利用Biolog代謝芯片技術(shù)評(píng)價(jià)青枯菌的代謝能力。將純培養(yǎng)的野生型Po82菌株、基因缺失菌株和互補(bǔ)菌株接種至NA固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h備用。將菌落釋放到IFA接種液中，調(diào)節(jié)濁度85%—95%，采用GENⅢ 96孔微孔板28℃培養(yǎng)（圖1），測(cè)定培養(yǎng)48、72、96、120、144 h后各個(gè)菌株的代謝情況[24]。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

在含0.5%瓊脂（g·L-1）的SMM半固體培養(yǎng)基上測(cè)定野生型和基因缺失菌株的運(yùn)動(dòng)性[25]。青枯菌在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期OD600=0.6—0.8時(shí)，離心收集細(xì)胞，用滅菌水洗滌兩次，稀釋至OD600=0.3。取5 μl菌液垂直加在SMM培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3—5 d，不倒置。青枯菌形成白色暈圈，通過(guò)測(cè)定平板菌落直徑分析菌株的運(yùn)動(dòng)性，每個(gè)菌株4個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 copA系統(tǒng)進(jìn)化分析

為深入探究青枯菌銅抗性編碼基因簇中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以耐金屬貪銅菌（）、稻黃單胞菌（）、大腸桿菌和假單胞菌中攜帶的該基因?yàn)閰⒄?，?gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果顯示，在青枯菌群體中廣泛存在，在親緣關(guān)系上與耐金屬貪銅菌最為緊密，與稻黃單胞菌、丁香假單胞菌和大腸桿菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2 本試驗(yàn)所用引物序列

單糖：monosaccharide；磷酸己糖：phosphohexose；氨基酸：amino acid；己糖酸：hexonic acid；羧酸、酯和脂肪酸：carboxylic acid, ester and fatty acid；酸度：acidity；乳酸：lactic acid；還原能力（四唑紫和四唑藍(lán)）：Reducing power (tetrazolium violet and tetrazolium blue)；革蘭氏陰性和陽(yáng)性檢測(cè)（萬(wàn)古霉素和萘啶酮酸）：Gram-negative and positive detection (vancomycin and nalidixic acid)

圖2 基于copA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 copA基因缺失菌株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的敲除載體pKMS1--gm擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶I和HI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，的左右臂長(zhǎng)度分別約為1 000和1 010 bp，加上中間的gm共2 986 bp，pKMS1-copA-gm載體片段總長(zhǎng)度為9.2 kb，酶切后剩余部分片段約為6.4 kb，雙酶切圖譜如圖3-A。酶切結(jié)果與測(cè)序比對(duì)得到copA基因缺失載體。將copA基因缺失載體轉(zhuǎn)化到野生型菌株，篩選出慶大霉素抗性和蔗糖抗性的菌株，PCR驗(yàn)證（圖3-C、3-D）和測(cè)序驗(yàn)證后，最終獲得基因缺失菌株。

的擴(kuò)增片段與互補(bǔ)載體連接后，PCR（圖3-B）與測(cè)序驗(yàn)證。將重組互補(bǔ)載體pBBR-copA轉(zhuǎn)化入基因缺失菌株后，構(gòu)建互補(bǔ)菌株，PCR（圖3-C、3-D）和測(cè)序驗(yàn)證最終獲得互補(bǔ)菌株。

2.3 copA缺失對(duì)青枯菌銅離子耐受能力的影響

為評(píng)價(jià)在青枯菌銅抗性中的作用，構(gòu)建了基因缺失菌株及其相應(yīng)互補(bǔ)菌株，采用MIC法測(cè)定青枯菌的銅抗性水平。Po82野生型菌株的MIC值為1.2 mmol·L-1，基因缺失菌株的MIC值降至0.8 mmol·L-1，銅抗性水平下降了33.3%，互補(bǔ)菌株恢復(fù)了與野生型菌株相當(dāng)?shù)目广~能力。

2.4 copA的誘導(dǎo)表達(dá)分析

Po82菌株在常規(guī)（非銅脅迫）培養(yǎng)條件下，其攜帶的在不同生長(zhǎng)階段均以本底水平表達(dá)；在不同CuSO4濃度的脅迫下，與對(duì)照組相比，表達(dá)量隨CuSO4誘導(dǎo)濃度的增加而增加，差異顯著。其中基因表達(dá)量最高的CuSO4濃度為1.0 mmol·L-1，是對(duì)照組基因表達(dá)量的85.6倍（圖4）。

A：缺失載體酶切驗(yàn)證圖The enzyme cutting verification diagram of deletion plasmid；B：互補(bǔ)載體驗(yàn)證圖（copA Testf/r）The verification diagram of complementary carrier (copA Testf/r)；C：敲除及互補(bǔ)菌株引物檢測(cè)（759f/760r；1—4：Po82野生型菌株、copA缺失菌株、copA互補(bǔ)菌株、空白對(duì)照）The detection of deletion and complementary strains(759f/760r; 1-4: Po82 wild-type strain, copA gene deletion strain, copA complementary strain and the control)；D：敲除及互補(bǔ)菌株引物檢測(cè)（copAf/r；1—4：Po82野生型菌株、copA互補(bǔ)菌株、copA缺失菌株、空白對(duì)照）The detection of deletion and complementary strains (copAf/r; 1-4: Po82 wild-type strain, copAcomplementary strain, copA gene deletion strain and the control)

柱上星號(hào)表示不同誘導(dǎo)濃度下，基因表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）

2.5 copA對(duì)青枯菌在銅逆境條件下生長(zhǎng)的影響

在NA培養(yǎng)基中，與野生型菌株P(guān)o82相比，基因缺失菌株ΔPo82copA在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率顯著下降，基因缺失菌株與互補(bǔ)菌株之間無(wú)顯著差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，基因缺失菌株及互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)速率較野生型菌株之間無(wú)顯著差異（圖5-A）。在添加了0.6 mmol·L-1CuSO4的NA培養(yǎng)基中，與野生型菌株相比，基因缺失菌株在遲緩期已達(dá)顯著差異，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率顯著下降（圖5-B）。互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)速率較低，互補(bǔ)菌株的構(gòu)建是將的開(kāi)放閱讀框連接在互補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1mcs-4載體的，RT-qPCR結(jié)果顯示持續(xù)表達(dá)（結(jié)果未顯示），因此推測(cè)可能是因?yàn)榛パa(bǔ)菌株中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致生長(zhǎng)速率下降。

2.6 copA的缺失對(duì)青枯菌致病性的影響

采用傷根法接種番茄植株探究對(duì)青枯菌致病性的影響。結(jié)果顯示，接種第6天開(kāi)始，野生型菌株與基因缺失菌株開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病萎蔫現(xiàn)象，二者無(wú)顯著差異。接種第7—10天，基因缺失菌株與野生型菌株之間差異顯著。接種第10天，基因缺失菌株的病情指數(shù)為45.3，病情指數(shù)較野生型Po82菌株下降了11.7%。接種13 d后恢復(fù)與野生型菌株相當(dāng)?shù)闹虏×Γ▓D6）?；パa(bǔ)菌株恢復(fù)了其部分的致病力。

采用RT-qPCR測(cè)定基因缺失菌株中與致病相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與野生型菌株相比，、的表達(dá)量顯著下調(diào)（圖7）。

A：NA培養(yǎng)基NA medium；B：添加0.6 mmol·L-1 CuSO4的NA培養(yǎng)基 NA medium added 0.6 mmol·L-1 CuSO4

圖6 青枯菌野生型菌株、copA基因缺失和互補(bǔ)菌株接種番茄后致病力測(cè)定

2.7 copA基因缺失對(duì)青枯菌代謝活性的影響

為了探究對(duì)青枯菌代謝通路的影響，采用Biolog代謝芯片技術(shù)測(cè)定了野生型菌株和基因缺失、互補(bǔ)菌株對(duì)96種底物（包括糖類、氨基酸、脂肪酸、羧酸）的代謝利用情況。結(jié)果表明，基因缺失菌株對(duì)-D-葡萄糖（微孔板C1）、D-海藻糖（微孔板A4）等碳源和L-丙氨酸（微孔板E3）、葡萄糖醛酰胺（微孔板F6）等氮源在代謝上有明顯差距（圖8）。

2.8 copA基因缺失對(duì)青枯菌運(yùn)動(dòng)性的影響

運(yùn)動(dòng)性在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。將野 生型菌株、基因缺失和互補(bǔ)菌株接種至5%SMM半固體培養(yǎng)基上，用十字交叉法測(cè)定運(yùn)動(dòng)性（圖9），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[26]。與野生型菌株相比，缺失和互補(bǔ)菌株運(yùn)動(dòng)能力變化差異不顯著。

圖7 青枯菌野生型菌株、copA基因缺失菌株致病相關(guān)基因表達(dá)分析

紫色孔定義為陽(yáng)性，淺于紫色的孔定義為邊界值。該圖分別表示野生型菌株、基因缺失菌株ΔPo82copA和互補(bǔ)菌株pBBR-ΔPo82copA在培養(yǎng)96 h后的代謝結(jié)果。α-D-葡萄糖（微孔板C1）在3種菌株的OD590分別為0.632、0.521、0.372；D-海藻糖（微孔板A4）在3種菌株的OD590分別為0.620、0.480、0.383；L-丙氨酸（微孔板E3）在3種菌株的OD590分別為0.786、0.370、0.436；葡萄糖醛酰胺（微孔板F6）在3種菌株的OD590分別為0.566、0.388、0.380

圖9 青枯菌野生型菌株、copA基因缺失和互補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)性

3 討論

生境中銅脅迫水平的變化可誘導(dǎo)細(xì)菌中銅抗性編碼系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)外排、隔離/累積以及介導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變等機(jī)制，抵御過(guò)量銅對(duì)自身正常生理過(guò)程的干擾。細(xì)菌攜帶的銅抗性編碼系統(tǒng)大都存在于接合質(zhì)粒等可移動(dòng)遺傳因子上（mobile genetic elements，MGEs），如之于丁香假單胞菌的pP14-32質(zhì)粒，之于大腸桿菌的pRJ1004質(zhì)粒。相關(guān)研究表明，銅抗性編碼基因簇可通過(guò)質(zhì)粒接合等水平基因轉(zhuǎn)移事件賦予相同生態(tài)位中敏感菌株以銅抗性。Altimira等[27]基于土壤宏基因組的研究結(jié)果顯示，3份不同地理來(lái)源的銅污染農(nóng)田土中均可檢測(cè)到；反之，無(wú)污染農(nóng)田土中則檢測(cè)不到該基因。耐金屬貪銅菌攜帶了兩套銅抗性編碼系統(tǒng)，一套位于大質(zhì)粒（等同于第二染色體），另一套位于小質(zhì)粒pMOL30。青枯菌Po82菌株中單一拷貝的基因簇同樣位于大質(zhì)粒上，基于系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，青枯菌在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上與耐金屬貪銅菌同源性最高。PRior等[28]基于、和等青枯菌持家基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將青枯菌進(jìn)一步劃分為與地理起源密切相關(guān)的4個(gè)演化型：演化型I對(duì)應(yīng)亞洲分支菌株；演化型Ⅱ?qū)?yīng)美洲分支菌株；演化型Ⅲ對(duì)應(yīng)非洲分支菌株；演化型Ⅳ對(duì)應(yīng)印尼分支菌株。本研究基于構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與基于上述持家基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)具有相同的分支結(jié)構(gòu)[5]，表明該基因可能是青枯菌核心基因組成員，隨青枯菌祖先基因共同進(jìn)化。

RT-qPCR結(jié)果顯示的表達(dá)受胞外銅離子信號(hào)的誘導(dǎo)，其表達(dá)量在亞抑制濃度范圍內(nèi)（≤1.0 mmol·L-1）隨銅離子濃度的增加而上調(diào)，證實(shí)是青枯菌Po82菌株銅抗性所必需的?；蚍聪蜻z傳學(xué)研究手段進(jìn)一步探明了該基因缺失后，Po82菌株的銅耐受水平顯著降低；pBBR-ΔPo82copA恢復(fù)部分銅抗性水平。本研究中的編碼產(chǎn)物為可能的周質(zhì)蛋白，其缺失導(dǎo)致Po82菌株的銅耐受性下降，但MIC值仍高于不攜帶基因簇的銅敏感青枯菌株P(guān)o40的0.4 mmol·L-1，推測(cè)原因可能為：（1）基因簇中的、和編碼產(chǎn)物參與了宿主菌Po82應(yīng)對(duì)銅脅迫的應(yīng)答反應(yīng)；（2）Po82菌株中攜帶的Cus（RND）和P-ATPase等銅代謝基因（簇）[29]與cop銅抗性基因簇相互協(xié)同以應(yīng)對(duì)外界銅逆境的脅迫。但采用何種方式相互作用，尚需進(jìn)一步深入研究。

Zhang等[30]報(bào)道微生物銅抗性基因與致病性具有一定聯(lián)系，熒光假單胞菌（）基因缺失菌株在甜菜和豌豆植株根部競(jìng)爭(zhēng)性定殖的能力降低。在本研究中，基因缺失菌株對(duì)番茄的致病力與野生型菌株相比顯著下降；RT-qPCR結(jié)果同時(shí)顯示基因缺失菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)調(diào)控基因與效應(yīng)子編碼基因、和的表達(dá)量顯著下降，表明銅抗性編碼基因部分參與了青枯菌的致病過(guò)程。Ⅲ型分泌系統(tǒng)在青枯菌成功完成侵染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，相關(guān)研究也已證實(shí)青枯菌通過(guò)外膜受體蛋白PrhA（plant regulator of）感知寄主信號(hào)，并通過(guò)級(jí)聯(lián)依次將信號(hào)傳遞并激活、、和等轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)?；蚓幋a產(chǎn)物通過(guò)與Ⅲ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白及效應(yīng)蛋白編碼基因上游的順式作用元件結(jié)合，啟動(dòng)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組裝形成及Ⅲ型效應(yīng)子的泌出[31-33]。銅抗性編碼基因如何與Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控基因與相互作用，并參與青枯菌的致病過(guò)程，值得進(jìn)一步深入研究。Biolog代謝分析表明，基因缺失菌株ΔPo82copA對(duì)-D-葡萄糖、D-海藻糖等碳源的代謝利用效率顯著降低，以上碳源存在于植株維管束和胞間液流中，青枯菌通過(guò)自身分泌的胞外酶分解代謝利用這些碳源，有助于在寄主維管束中侵染。因此，青枯菌對(duì)這些碳源的代謝利用程度關(guān)系到青枯菌對(duì)寄主的侵染過(guò)程。這一結(jié)果也佐證了基因缺失菌株ΔPo82copA的致病力較野生型降低。

4 結(jié)論

對(duì)青枯菌銅抗性編碼基因進(jìn)行了功能分析,該基因在青枯菌銅脅迫應(yīng)答、致病性等生物學(xué)功能上發(fā)揮著重要作用，研究結(jié)果有助于進(jìn)一步深入解析青枯菌銅抗性的分子調(diào)控機(jī)制，并可為銅抗性菌株的有效治理提供理論依據(jù)。

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Function of Copper-resistant Geneof

WANG XiaoNing, LIANG Huan, WANG Shuai, FANG WenSheng, XU JingSheng, FENG Jie, XU Jin, CAO AoCheng

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【Objective】 Bacterial wilt of plants, caused by, is a major soil-borne disease around the world. As an important bactericide to control bacterial diseases such as bacterial wilt, the widespread use of copper-based bactericides has led to the emergence of copper-resistant strains in a variety of plant pathogenic bacterial population. The copper-resistant coding gene, homologous with, was carried on the megaplasmid ofPo82 strain. The objective of this study is to investigate the biological function ofin copper resistance and pathogenicity of Po82 strain.【Method】The phylogenetic relationship of the copper-resistant genein different strains ofand other phytobacterial strains was analyzed based on neighbor-joining method using MEGA6.0 for constructing the phylogenetic tree of. By means of reverse genetics strategy, using the methods of gene homologous recombination and electroporation,gene deletion and complementary strains of Po82 were constructed. Copper minimal inhibition concentration (MIC) test, RT-qPCR, Biolog chip analysis, pathogenicity test and other basic biological methods were employed to clarify the relationship betweenand biological characteristics such as response to copper stress, metabolic activity, pathogenicity, and motility of【Result】The results of homology analysis showed that theexisted widely in the bacterial population, and theofwas most closely related to, but far genetic relationship with,and. RT-qPCR analysis showed that the expression ofwas induced by copper. The expression ofincreased with the increase of CuSO4concentration. Theexpression level ofwas the highest when the CuSO4concentration was 1.0 mmol·L-1. By MIC analysis, the result showed that the sensitivity of thedeletion strain to copper was significantly increased. The MIC value ofdeletion strain was 0.8 mmol·L-1, which decreased by 33.3% compared with that of wild-type strain (1.2 mmol·L-1). The complementary strain restored copper resistance. The results indicated thatplayed an important role in copper resistance of. Compared with wild-type strain, the logarithmic growth rate ofgene deletion strain decreased in both NA medium and NA medium containing 0.6 mmol·L-1CuSO4, indicating thatwas related to the growth rate of.The absence ofresulted in a decrease in the pathogenicity of. On the 10th day of inoculation, the disease index of thegene deletion strain decreased by 11.7% compared with that of the wild-type strain Po82. The absence ofresulted in a reduction of metabolic utilization rate of carbon sources such as-D-glucose, D-trehalose and nitrogen sources such as L-alanine and glucuronide. Compared with wild-type strain Po82, the expression level of,andgenes, which are important components of the type Ⅲ secretion system, was also significantly down-regulated ingene deletion strain. 【Conclusion】 The copper-resistant geneplays an important role in copper stress response and pathogenicity of. The results provide a theoretical basis for further analysis of copper resistance mechanism and the control of copper-resistant strains.

; copper-resistant;; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.05.006

2018-10-30；

2018-11-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201600，2018YFD0200802）、國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD08B03）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31571975）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-XTCX2016012）

王曉寧，E-mail：18811012063@163.com。通信作者徐進(jìn)，E-mail：jinxu@ippcaas.cn。通信作者曹坳程，E-mail：caoac@vip.sina.com

（責(zé)任編輯 岳梅）