王晶雪 王曉慶 陸 葉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100034)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是中老年女性常見疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前已有研究?jī)H從盆底支持結(jié)構(gòu)的膠原蛋白的含量、膠原亞型的比例變化等方面探討POP的發(fā)生機(jī)制，而對(duì)子宮骶韌帶細(xì)胞基因方面的研究較少[1,2]。線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，不僅是細(xì)胞能量提供和儲(chǔ)存的場(chǎng)所，還在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[3]。人線粒體DNA4977(mitochondrial DNA4977，mtDNA4977)會(huì)隨著年齡的增大而逐漸缺失，與機(jī)體老化相關(guān)[4]，但這些研究?jī)H局限在心腦血管系統(tǒng)等[5,6]，而線粒體DNA4977缺失在盆底組織支持結(jié)構(gòu)中的研究較少。由于POP也是公認(rèn)的與老化相關(guān)的疾病，因此，本研究通過線粒體DNA4977缺失在盆腔器官脫垂患者子宮骶韌帶中的變化，初步探討POP發(fā)生的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過[2016(1173)]。選取2016年9月～2017年4月我科因POP Ⅱ～Ⅳ期(Ⅱ期5例、Ⅲ期16例、Ⅳ期5例)行子宮切除術(shù)的患者26例為研究組，同一時(shí)期因良性非POP疾病行子宮切除術(shù)的21例患者(其中子宮腺肌癥1例、子宮肌瘤11例、子宮內(nèi)膜異常增生4例、宮頸病變4例、絕經(jīng)后雙側(cè)卵巢囊腫1例)為對(duì)照組。近3個(gè)月內(nèi)無尿道感染、陰道手術(shù)史，未服用雌激素類藥物。2組年齡、體重指數(shù)(BMI)、產(chǎn)次(均為陰道分娩)、難產(chǎn)史、孕次、初產(chǎn)年齡、絕經(jīng)年齡等方面均無顯著差異(表1)。

表1 2組臨床特征參數(shù)比較

注：難產(chǎn)史研究組包括產(chǎn)鉗或胎吸助產(chǎn)5例(其中2例巨大兒)，巨大兒1例；對(duì)照組產(chǎn)鉗助產(chǎn)3例(其中1例巨大兒)，巨大兒1例

1.2 主要試劑

GENMED動(dòng)物硬組織線粒體DNA萃取試劑盒購于美國(guó)Genmed Scientifics公司；TransStart Top Green qPCR Super Mix試劑盒、DNA分子量Marker、Loading buffer、Gel-red核酸染料均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；特異性引物合成購于北京天一輝遠(yuǎn)生物公司；瓊脂糖購于美國(guó)Gibco公司，并配成2%瓊脂糖凝膠；TAE緩沖液購于北京雷根生物技術(shù)有限公司，并配置成1∶50 TAE液；溴酚藍(lán)購于美國(guó)VWR。

1.3 主要儀器

超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific ULT1386-3V)，PCR儀(德國(guó)Eppendorf)，Real Time PCR System 7500(美國(guó)Applied Biosystems)，凝膠成像分析系統(tǒng)4000MM PRO(美國(guó)柯達(dá))，NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo)。

1.4 標(biāo)本收集及處理

手術(shù)均由同一術(shù)者完成。術(shù)前根據(jù)POP-Q評(píng)分法由術(shù)者評(píng)定有無脫垂以及脫垂程度[7]，并簽署知情同意書。切除子宮后，術(shù)者從子宮標(biāo)本上取子宮骶韌帶與宮頸連接處外0.5 cm處的子宮骶韌帶組織約0.5 cm大小，立即投入液氮保存，再轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存至提取DNA時(shí)。

1.5 子宮骶韌帶線粒體DNA萃取

按照GENMED動(dòng)物硬組織線粒體DNA萃取試劑盒操作方法，提取子宮骶韌帶線粒體DNA。用NanoDrop 2000測(cè)定樣品線粒體DNA純度和濃度(OD260/OD280值1.2～1.9，DNA濃度>10 ng/μl為合格樣品)。

1.6 線粒體DNA含量和線粒體DNA4977缺失檢測(cè)

參照Genbank序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物序列，由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成目的基因和內(nèi)參基因特異性引物，見表2。

取1 μl線粒體DNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒使用說明，在熒光定量PCR儀進(jìn)行目的基因(線粒體DNA含量、線粒體DNA4977缺失)和內(nèi)參基因(GAPDH)的擴(kuò)增。每個(gè)孔重復(fù)3次進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。用2-ΔΔCT計(jì)算目標(biāo)基因?qū)?nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳照膠。

表2 線粒體DNA和線粒體DNA4977缺失引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究組(脫垂組)和對(duì)照組(非脫垂組)患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失和線粒體DNA總含量比較

熒光定量PCR顯示研究組子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。而2組子宮骶韌帶組織線粒體DNA總含量無顯著差異(P=0.447)，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物確為線粒體DNA4977缺失(圖1、表3)。

圖1 脫垂組和非脫垂組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 POP-Q分期與子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失的關(guān)系

將對(duì)照組定義為POP-Q分期的0期，比較所有患者POP-Q分期與子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977

表3 2組子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失和線粒體DNA相對(duì)含量比較(熒光定量PCR法)

缺失的關(guān)系。雖然各期患者子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著POP分期的升高，子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失有增加的趨勢(shì)(P=0.171)(表4)。

2.3 研究組和對(duì)照組患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失的相關(guān)性分析

研究組(脫垂組)患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失與年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、初產(chǎn)年齡、絕經(jīng)年齡均無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表5和圖2)。對(duì)照組(非脫垂組)線粒體DNA4977缺失與年齡有明顯相關(guān)性，隨著年齡的增加，線粒體DNA4977缺失增多(r=0.465，P=0.034)，而與BMI、孕次、產(chǎn)次、初產(chǎn)年齡、絕經(jīng)年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表5和圖3)。

表4 不同POP分期患者子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失的相對(duì)含量(熒光定量PCR法)

表5 研究組和對(duì)照組患者線粒體DNA4977缺失的相關(guān)性分析

圖2 研究組(脫垂組)患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失與年齡的相關(guān)性

圖3 對(duì)照組(非脫垂組)患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失與年齡的相關(guān)性

3 討論

由于POP的發(fā)病機(jī)制并不清楚，臨床尚無滿意的預(yù)測(cè)和根治方法。隨著年齡的增加，POP的發(fā)生率逐漸增高。Swift等[8]觀察到，年齡每增加10歲，POP發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加10%。這只是從現(xiàn)象上證實(shí)了POP與年齡和衰老具有相關(guān)性。我們的研究著手于線粒體DNA及線粒體DNA4977缺失，從基因的角度探討POP發(fā)生的相關(guān)因素，為預(yù)測(cè)POP和對(duì)POP的治療提供可能的線索。

線粒體DNA4977缺失是線粒體DNA突變的一種常見且重要的類型[9]。該缺失位于線粒體DNA序列的8470nt與13 447nt之間，被認(rèn)為是產(chǎn)生缺失的熱點(diǎn)區(qū)域。線粒體DNA4977片段包括ATPase8、ATPase6、COIII、ND3、ND4、ND5等編碼的基因。這些基因的缺失，會(huì)引起呼吸鏈故障和三磷酸腺苷(ATP)生成減少，干擾有氧代謝，并產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織出現(xiàn)功能障礙。目前多項(xiàng)研究表明，線粒體DNA突變與衰老、氧化應(yīng)激有關(guān)[10]。

3.1 POP患者子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失增多

本研究中，與相匹配的對(duì)照組相比，研究組(POP組)患者子宮骶韌帶組織線粒體DNA4977缺失增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)骶韌帶中線粒體DNA4977缺失導(dǎo)致骶韌帶中能量供給降低，以致骶韌帶功能下降，從而導(dǎo)致POP的發(fā)生。本研究中，隨著盆腔器官脫垂的POP-Q分期的增加，子宮骶韌帶組織中線粒體DNA4977缺失逐漸增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是由于樣本量較少。與Sun等[11]的報(bào)道一致。但是本研究中，子宮骶韌帶組織線粒體DNA總拷貝數(shù)在研究組和對(duì)照組并沒有明顯差異，與Sun等[11]的報(bào)道有差異，與本研究樣本量較少有關(guān)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。

3.2 線粒體DNA4977缺失與年齡

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組患者子宮骶韌帶中線粒體DNA4977缺失與年齡呈正相關(guān)，年齡越大，線粒體DNA4977缺失越多，與張幼芳[12]報(bào)道一致，該研究顯示，在人類骨骼肌中，不同年齡組(0～9，10～19，20～29，30～39，40～49，50～59，60～69，70～79，80～89，90～99)中線粒體DNA4977缺失比例分別為0%、0%、0.003%、0.011%、0.015%、0.033%、0.038%、0.062%、0.069%和0.091%。但本研究中研究組(脫垂組)患者線粒體DNA4977缺失與年齡卻無明顯相關(guān)性，而在非脫垂患者中，線粒體DNA4977缺失與年齡呈正相關(guān)，提示POP患者可能在相對(duì)年齡比較小時(shí)，已經(jīng)存在較多線粒體DNA4977缺失，可能是導(dǎo)致POP發(fā)生的原因。本研究中雖然研究組和對(duì)照組年齡在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，但研究組年齡均值較對(duì)照組畢竟大了3歲多，是否由于年齡不均衡擴(kuò)大了組間差異？我們認(rèn)為，線粒體DNA4977缺失雖然隨著年齡增加而增加，但其增加的趨勢(shì)是非常緩慢的，張幼芳[12]的研究提示線粒體DNA4977缺失在50～59歲組為0.033%，60～69歲組為0.038%，此區(qū)間大約10歲僅增加0.005%，但本研究中，研究組平均61歲，對(duì)照組平均58歲，2組僅相差3歲左右，且2組間線粒體DNA4977缺失的差異非常大，故我們考慮并沒有因?yàn)?組間很小的年齡差異而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

3.3 檢測(cè)POP患者子宮骶韌帶組織中線粒體DNA和線粒體DNA4977缺失的臨床意義

研究表明外周血或組織中線粒體DNA4977缺失有可能會(huì)成為某些疾病的生物標(biāo)記，可以用于相關(guān)疾病的檢測(cè)。比如Lee等[13]觀察到外周血線粒體DNA4977缺失與心房顫動(dòng)和重構(gòu)相關(guān)，提示檢測(cè)外周血線粒體DNA4977缺失可能成為心律失常的生物標(biāo)記物。本研究中，骶韌帶線粒體DNA4977缺失在POP患者中明顯升高，提示線粒體DNA4977缺失有可能會(huì)成為POP的生物標(biāo)記物。對(duì)于有POP高危因素者，檢測(cè)組織中線粒體DNA和線粒體DNA4977缺失情況，或許可以用于臨床上預(yù)測(cè)POP的發(fā)生，及早進(jìn)行有效干預(yù)，改善POP的預(yù)后。

綜上所述，骶韌帶線粒體DNA4977缺失在POP患者中顯著增加且在POP患者中早發(fā)生，可能是導(dǎo)致POP的原因之一。由于本研究的樣本量小，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究。在今后的研究中，我們還會(huì)同時(shí)測(cè)量患者血液中線粒體DNA4977缺失含量，進(jìn)一步了解其生物學(xué)意義。