陳力群 譚晴晴 陳雪燕 劉利平 劉國(guó)霞 胡悅 范陽(yáng)陽(yáng) 劉艷艷 步迅 張全芳

摘要：本研究以桑黃為材料，篩選出一種快速直接提取子實(shí)體DNA的方法。利用CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)分別對(duì)桑黃子實(shí)體基因組DNA進(jìn)行提取，結(jié)果表明，硅珠DNA純化技術(shù)的提取效果最好，試劑盒方法次之。經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測(cè)序得到桑黃的rDNA ITS序列，通過BLAST比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的樣品為哈爾蒂木層孔菌Phellinus hartigii。

關(guān)鍵詞：桑黃;DNA提取;ITS;分子檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S567.3??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A??文章編號(hào)：1001-4942（2019）01-0018-05

Extraction Method Optimization and Molecular

Identification of Phellinus igniarius Genomic DNA

Chen Liqun?1，Tan Qingqing?2，Chen Xueyan?2， Liu Liping?3， Liu Guoxia?2，

Hu Yue?2， Fan Yangyang?2， Liu Yanyan?2， Bu Xun?2，Zhang Quanfang?2

（1. High School Attached to Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

2. Bio-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

3. Shandong Academy of Agricultural Sciences Community Health Service Station of Quanfu Office

in Licheng District of Jinan City， Jinan 250100， China）

Abstract?Using Phellinus igniariusas as research materials， a method for rapidly extracting DNA from Phellinus igniarius was screened. The genomic DNA of Phellinus igniarius was respectively extracted by CTAB method， DNA extract kit and silica bead DNA purification technology. The results showed that the extraction method of silica bead DNA purification technology was the best， and the kit method was the second. The ITS gene sequence of Phellinus igniarius was obtained by PCR amplification and sequencing. By the BlAST sequence alignment and the construction of phylogenetic tree， we found the detected sample was Phellinus hartigii.

Keywords?Phellinus igniarius; DNA extraction; ITS; Molecular detection

桑黃（Phellinus igniarius）是一類珍貴的藥用真菌的統(tǒng)稱，又稱桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃菇，素有“森林黃金”的美稱[1]，最早記載于《藥性論》中。傳統(tǒng)中醫(yī)中用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)础⒚摳匦寡?、帶下、閉經(jīng)等[2];現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究中，具有抗癌、抗菌、抗纖維化、保肝等療效[3]，是最近幾年開發(fā)的一種多年生珍貴藥用真菌。全世界銹革孔菌科有約470個(gè)名稱，針層孔菌屬有430個(gè)名稱，我國(guó)目前報(bào)道的銹革孔菌科有106種，針層孔菌屬有40種，其中針層孔菌屬中桑黃家族主要有：火木層孔菌（Phellinus igniarius）、針裂蹄木層孔菌（Phellinus linteus）、鮑姆針層孔菌（Phellinus baumii）等[4]。由于野生桑黃多生于松、楊、柳、樺、桃、櫟樹等闊葉樹的枯立木或者樹干上[5]，其子實(shí)體呈褐色馬蹄形，大小不一，外觀形態(tài)相似，很難依賴于形態(tài)特征進(jìn)行鑒別，往往出現(xiàn)“同名異物”或“同物異名”的現(xiàn)象[6]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)[7]、RFLP[8]和RAPD[9]被逐漸應(yīng)用于桑黃基源成分的鑒定。由于ITS序列具有種內(nèi)菌株間相對(duì)保守，而種間差異比較明顯的特點(diǎn)，非常適合真菌的物種鑒定和物種起源、多樣性評(píng)價(jià)及親緣關(guān)系的鑒定。因此基于rDNA ITS序列進(jìn)行桑黃基源鑒定也成為首選方法，同時(shí)高質(zhì)量DNA的提取也成為影響分子研究的關(guān)鍵。目前，桑黃主要是先進(jìn)行子實(shí)體的分離、菌絲的培養(yǎng)，最后對(duì)培養(yǎng)菌絲進(jìn)行基因組DNA提取。這樣菌絲培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)過程中存在污染問題。因此本實(shí)驗(yàn)室采用CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)對(duì)桑黃子實(shí)體DNA進(jìn)行直接提取，并通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序、BLAST比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，得出一種操作簡(jiǎn)便、DNA提取質(zhì)量高、耗時(shí)短且費(fèi)用低廉的優(yōu)化方法，以便應(yīng)用于桑黃物種鑒定、遺傳分析等，為開展后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)桑黃樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1.2?儀器設(shè)備

主要有：7500 Real-Time PCR儀（賽默飛世爾科技公司）、紫外分光光度計(jì)SMA1000（北京美林恒通有限公司）、臺(tái)式離心機(jī)5424R（德國(guó)Eppendorf）、ABI 3730xl DNA 測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）、Bio-Rad ChemicDoc??TM??XRS +凝膠成像系統(tǒng)、B960 PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）等。

1.3?試劑

主要有：裂解液FP1、醋酸鉀、洗滌液PW1，Proteinase K、硅珠、DNA Binding Buffer、75%乙醇、TE緩沖液、超純水、EasyPure Genomic DNA Kit ?（TRAN公司）、Plant Genomic DNA Kit （TIANGEN公司）、EasyTaq Buffer、EasyTaq DNA Polymerase （北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4?基因組DNA提取

（1）方法A：根據(jù)文獻(xiàn)[10]中CTAB方法提取桑黃子實(shí)體基因組DNA。

（2）方法B：參照TIANGEN真菌DNA提取試劑盒，具體提取方法參考說明書操作。

（3）方法C：將桑黃子實(shí)體表面用75%乙醇擦拭及超純水沖洗2遍，稱取樣品50～100 mg用滅菌的研缽研磨，轉(zhuǎn)入2 mL離心管后，加入500 μL裂解液FP1以及100 μL 醋酸鉀振蕩混勻，56℃裂解10 min， 12 000 r/min離心2 min;取上清于新的離心管中，加入2倍體積的DNA結(jié)合液和20 μL硅珠，充分混勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清液;加入500 μL漂洗液進(jìn)行洗滌，?12 000??r/min離心1 min，重復(fù)此步驟2次;加入?700 μL?無(wú)水乙醇，吹打懸浮，8 000 r/min離心1 min，棄上清液;8 000 r/min離心30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫干燥10 min;加入50 μL TE緩沖液溶解DNA。

1.5?基因組DNA濃度和純度檢測(cè)

5 μL DNA提取液用2%瓊脂糖凝膠，在150 V電壓下電泳10 min后取出，溴乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察并拍照記錄。另外，取2 μL DNA提取液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度以及A?260?和A?280?。

1.6?PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中EasyTaq聚合酶0.2 μL，10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 μmol/L）2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA模板2.0 μL（20～50 ng/μL），ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[11]。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min，16℃保存。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。然后將PCR產(chǎn)物切膠純化，利用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.7?數(shù)據(jù)分析

測(cè)序峰圖利用SeqMan軟件校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，獲得rDNA ITS序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)桑黃進(jìn)行同源性分析。

1.8?系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從GenBank中下載18條桑黃菌株的rDNA ITS序列，利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2?結(jié)果與分析

2.1?桑黃基因組DNA檢測(cè)

分別取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果顯示，方法A提取的DNA有條帶，但有降解現(xiàn)象，而方法B和方法C提取的基因組DNA無(wú)條帶（圖1）。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA濃度和純度（表1），可以看出，方法A的濃度明顯高于方法B、C，但提取的DNA含有色素;方法A和B的A?260?/A?280?均存在比值小于?1.8?或大于2.0的現(xiàn)象，說明樣品在基因組DNA提取過程中存在部分蛋白、酚類及RNA的污染。方法C的A?260?/A?280?比值在?1.8～?2.0之間，濃度在50 ?ng/μL左右，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求。

2.2?PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序

以三種方法提取的基因組DNA為模板，采用ITS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方法B和方法C提取的DNA均能擴(kuò)增出一條明顯的特異性條帶，分子量740 bp左右（圖2）。DNA測(cè)序結(jié)果見圖3。另外，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST工具對(duì)桑黃rDNA ITS序列進(jìn)行比對(duì)，與Phellinus hartigii的同源性為100%，ITS序列見圖4。

2.3?系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

基于從GenBank中下載的18條桑黃菌株rDNA ITS序列，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果顯示，檢測(cè)樣品與登錄號(hào)為KY750527.1和JX093788.1的哈爾蒂木層孔菌（Phellinus hartigii）菌株親緣關(guān)系最近，其序列相似度均為100%，因此初步鑒定檢測(cè)樣品為哈爾蒂木層孔菌。

3?討論與結(jié)論

目前，桑黃基因組DNA提取主要是通過培養(yǎng)菌絲，然后利用傳統(tǒng)的CTAB法或SDS方法進(jìn)行提取。而菌絲的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要3～7天，在培養(yǎng)過程中還會(huì)遇到其他菌類污染的問題。為了較快且準(zhǔn)確地進(jìn)行分子鑒定，獲取高質(zhì)量的DNA，本試驗(yàn)通過CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)三種方法對(duì)桑黃子實(shí)體直接進(jìn)行基因組DNA提取，并利用紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳分析以及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增技術(shù)對(duì)三種方法提取的DNA濃度、純度及后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)應(yīng)用性等方面進(jìn)行評(píng)估。方法A采用CTAB法，提取時(shí)間較長(zhǎng)，且存在酚、氯仿等揮發(fā)性有毒物質(zhì)，在提取過程中雖然獲得的DNA產(chǎn)量較大，凝膠電泳可以看到明顯條帶，但是DNA溶液存在色素，影響后續(xù)PCR擴(kuò)增。方法B采用試劑盒進(jìn)行提取，獲得的DNA產(chǎn)量小雜質(zhì)少，但是價(jià)格相對(duì)偏高。而方法C采用硅珠DNA純化技術(shù)，其純度和濃度均能滿足后續(xù)分子檢測(cè)的需要，且PCR擴(kuò)增條帶單一。對(duì)方法B和C提取的基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及BLAST比對(duì)，并進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示檢測(cè)樣品與哈爾蒂木層孔菌（Phellinus hartigii）同源性最高，可確定為哈爾蒂木層孔菌。說明提取的桑黃基因組DNA可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)要求，為桑黃物種的分子鑒定提供技術(shù)支持。在實(shí)際操作中，可以根據(jù)試驗(yàn)條件選擇方法B（試劑盒法）或方法C（硅珠DNA純化技術(shù)）。

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