趙慧 高艷榮 宋統(tǒng)球 賈玉巧

014060包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭

焦炭制造過程中產(chǎn)生的焦?fàn)t逸散物(COEs)成分復(fù)雜，其中COEs中的多環(huán)芳烴(PAHs)已被國際癌癥研究署(IARC)列為人類確定致癌物，PAHs是一類有毒化合物，有致癌性[1,2]。根據(jù)流行病學(xué)研究，PAHs與免疫功能受損有關(guān)，同時(shí)PAHs暴露還會(huì)增加肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3，4]。位于人12號(hào)染色體的IFN-γ由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗細(xì)菌感染、增強(qiáng)免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用[5]。苯并[a]芘(BaP)是PAHs中重要致癌物，Yanagisawa研究發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)接觸帶有螨蟲過敏原的BaP可誘導(dǎo)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞因子[6]。Al-Daghri研究結(jié)果顯示哮喘患兒IFN-γ mRNA表達(dá)和血清PAH水平有顯著相關(guān)性[7]。IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞因子，Wakita實(shí)驗(yàn)表明缺陷IFN-γ的小鼠，鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生率顯著升高[8]。免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)展中起重要作用。PAHs致癌過程中引起DNA甲基化已被證實(shí)在腫瘤中是非常重要的表觀遺傳[9]，但是PAHs職業(yè)接觸細(xì)胞因子DNA甲基化未有報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)研究了解焦?fàn)t工職業(yè)PAHs暴露與外周血血清IFN-γ表達(dá)關(guān)系及IFN-γ表觀遺傳機(jī)制在多環(huán)芳烴暴露損傷中的表現(xiàn)。

資料與方法

選擇包頭某焦化廠煉焦車間85名工人為暴露組，同廠不接觸COEs的輔助車間及行政部門人員47名為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均為男性，漢族，年齡18～60周歲。無明確的心血管、肝、腎、肺及自身免疫等疾病，無濫用藥物史，自愿按照要求參加體檢項(xiàng)目者。暴露組至少在煉焦車間工作1年以上，對(duì)照組工齡滿1年且在過去3個(gè)月內(nèi)沒有接觸過COEs。采集暴露組班后尿及對(duì)照組工人晨尿30 mL，紫色EDTA抗凝、橘黃色促凝采血管各采集血液標(biāo)本3 mL。均-80℃存儲(chǔ)，待分析。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

問卷調(diào)查：調(diào)查員統(tǒng)一培訓(xùn)后進(jìn)行問卷調(diào)查，調(diào)查表依據(jù)職業(yè)健康體檢表結(jié)構(gòu)進(jìn)行制作。調(diào)查表內(nèi)容包括個(gè)人信息、職業(yè)史、既往史以及家族史。吸煙定義為1支/d，且連續(xù)1年以上，飲酒為2次/周，連續(xù)半年以上。

主要儀器和試劑：HPLC裝置及色譜工作站、反相C18色譜柱A1260型熒光檢測(cè)器(Agilent Technologies公司，美國)；酶標(biāo)儀(Synergy/HT，美國伯騰儀器有限公司)；MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀(Agena， Inc)； 99.8%1-OHP 標(biāo) 準(zhǔn)品、99%咔唑標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer，GmbH德國)；人γ干擾素ELISA試劑盒、人尿肌酐ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；全血DNA提取試劑盒。

方法：采用堿水解-高效液相色譜熒光法檢測(cè)尿1-羥基芘(1-OHPyr)水平[10]。用ELISA法檢測(cè)尿肌酐含量校正尿1-OHPyr數(shù)值。標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線具有良好的線性(r=0.999 1)。檢測(cè)限：尿樣加標(biāo)確定儀器(3倍信噪比)檢測(cè)限0.01 ng/L。精密度為日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.31%～4.44%。準(zhǔn)確度是尿樣加標(biāo)回收率96%～110%。采用ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ的表達(dá)。嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作。采用DNA提取試劑盒抽提DNA后將樣本委托博淼生物科技(北京)有限公司采用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：全部數(shù)據(jù)資料采用EXCEL錄入，用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，連續(xù)性變量資料符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)，方差分析；定性資料用χ2檢驗(yàn)；使用協(xié)方差分析校正年齡、工齡、吸煙與飲酒；相關(guān)性分析采用多元線性回歸方法。

結(jié) 果

基本資料統(tǒng)計(jì)分析：暴露組和對(duì)照組間比較，吸煙史和飲酒史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

各組尿1-羥基芘濃度與外周血IFN-γ的表達(dá)：暴露組與對(duì)照組間，尿1-OHPyr濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且暴露組1-OHPyr濃度高于對(duì)照組。爐側(cè)、爐頂兩工種尿1-OHPyr濃度與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。暴露組中焦?fàn)t工血清IFN-γ水平低于對(duì)照組(P＜0.05)，爐頂工明顯高于爐底工(P＜0.05)，3個(gè)工種與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化分析：分析IFN-γ7個(gè)CpG位點(diǎn)，只有CpG-5有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暴露組甲基化率高于對(duì)照組，見表3。IFN-γ基因質(zhì)譜分析的屏幕截圖可見CPG-5顏色由深變淺，見圖1。

各變量間的相關(guān)性分析：采用多元線性回歸分析，IFN-γ為應(yīng)變量，其余為自變量。IFN-γ CPG-5甲基化率與IFN-γ含量呈負(fù)相關(guān)，尿1-OHPyr與IFN-γCPG-5甲基化率呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。只有IFN-γCPG-5甲基化率進(jìn)入方程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常數(shù)項(xiàng)69.497，β1=-82.438，見表4。

討 論

尿1-OHPyr是PAHs暴露的生物標(biāo)志物[11，12]。本次研究暴露組尿1-OHPyr濃度顯著高于對(duì)照組，說明焦?fàn)t工工作場(chǎng)所PAHs暴露高于對(duì)照人群工作環(huán)境，其中爐側(cè)工、爐頂工PAHs暴露相對(duì)較高。建議有關(guān)部門做好煉焦工藝改善和焦?fàn)t工個(gè)體防護(hù)，重點(diǎn)防護(hù)爐側(cè)與爐頂?shù)墓と耍⑶叶ㄆ谶M(jìn)行職業(yè)健康體檢。PAHs是免疫抑制類物質(zhì)，長(zhǎng)期暴露引起免疫功能受損，IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞因子[13]。本次研究焦?fàn)t工外周血IFN-γ含量低于對(duì)照組，提示職業(yè)性PAHs暴露可降低IFN-γ表達(dá)。DNA甲基化是重要的表觀遺傳，越來越多的證據(jù)證明了腫瘤抑制基因的高甲基化和表觀遺傳沉默的存在[14]。研究表明，兒童暴露于空氣污染物中DNA甲基化發(fā)生了改變[15]。Tang研究將Jurkat T細(xì)胞和兩種肺癌細(xì)胞系暴露于不同濃度BaP，引起IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)甲基化與IFN-γ表達(dá)水平改變[16]。結(jié)合本研究結(jié)果，IFN-γCPG-5甲基化率暴露組高于對(duì)照組，而且IFN-γ與IFN-γ CPG-5甲基化率呈負(fù)相關(guān)，IFN-γCPG-5甲基化率與1-OHPyr正相關(guān)，證實(shí)了IFN-γ與IFN-γCPG-5同職業(yè)性PAHs暴露有關(guān)聯(lián)，為更深入研究職業(yè)性PAHs暴露引起細(xì)胞因子表觀遺傳改變提供依據(jù)。

表1 兩組一般情況比較()

表1 兩組一般情況比較()

變量 暴露組 對(duì)照組 t/χ2 P n %n%年齡(歲) 85 40.72±7.32 47 39.60±8.72 t∶0.787 0.433工齡(年) 85 19.46±8.12 47 19.26±8.94 t∶0.133 0.895吸煙 是 37 43.5 9 19.1 χ2=7.924 0.005否 48 56.5 38 80.9飲酒 是 33 38.8 8 17.0 χ2=6.718 0.010否 52 61.2 39 83.0

表2 尿1-OHPyr與外周血IFN-γ在暴露組中不同工種與對(duì)照組間相互比較()

表2 尿1-OHPyr與外周血IFN-γ在暴露組中不同工種與對(duì)照組間相互比較()

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與爐底比較，#P＜0.05。

組別 n 1-OHPyr(μmol/mol Cr) IFN-γ(ng/L)暴露組 85 4.47±2.37 41.01±20.40爐側(cè) 29 5.28±2.42? 48.42±17.16?爐頂 32 4.14±2.16? 45.23±23.41?#爐底 24 3.93±2.41 26.43±10.34?對(duì)照組 47 2.63±1.46 73.00±26.07 F? 12.446 46.379 P? 0.001 ＜0.001

表3 IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)各位點(diǎn)甲基化水平分析()

表3 IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)各位點(diǎn)甲基化水平分析()

CPG 暴露組(n=18) 對(duì)照組(n=15) P CPG-1 0.77±0.22 0.82±0.10 0.433 CPG-2 0.86±0.07 0.87±0.09 0.774 CPG-3 0.78±0.08 0.77±0.10 0.687 CPG-4 0.85±0.07 0.82±0.08 0.329 CPG-5 0.52±0.18 0.33±0.22 0.011 CPG-6 0.80±0.07 0.78±0.06 0.328 CPG-7 0.71±0.36 0.64±0.43 0.645平均甲基化率 0.76±0.21 0.72±0.26 0.191

圖1 IFN-γ基因質(zhì)譜分析圖

表4 各變量間相關(guān)系數(shù)矩陣及檢驗(yàn)結(jié)果