任琦琦，任皓威，楊翠翠，劉 寧*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳酸菌胞外多糖（lactic acid bacteria-derived exopolysaccharide，LAB EPS）是乳酸菌發(fā)酵過程中的產(chǎn)物之一，在改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)構(gòu)特性、流變學特性和風味方面具有重要作用[1]，也在生物活性方面發(fā)揮著重要作用。一些研究者已經(jīng)報道了LAB EPS的抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)消化道[4]、免疫調(diào)節(jié)活性[5]等多種生物學活性。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）作為乳酸菌中的一種，被廣泛應用在乳制品發(fā)酵中。已有研究表明，干酪乳桿菌對人體健康的潛在益處包括清除有害菌[6]、維持腸道菌群多樣性[7]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[8]、降低膽固醇水平[9]、抗氧化和抗炎作用[10]等，而EPS作為L. casei發(fā)酵過程中的產(chǎn)物之一，在防止癌細胞增殖[11]、抗細胞毒性[12]等生物活性方面發(fā)揮著重要作用。

近年來的研究表明，益生菌發(fā)酵乳長時間干預機體可以提高腸黏膜免疫系統(tǒng)中樹突細胞（dendritic cells，DCs）的數(shù)量[13-14]，而EPS作為發(fā)酵產(chǎn)品中重要的生物活性成分，可能發(fā)揮一定作用。另據(jù)報道，多糖能夠刺激小鼠骨髓來源樹突細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）的體外成熟[15-18]。DCs作為抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC），其功能是目前所知最強大的，它能夠引發(fā)并調(diào)節(jié)免疫反應[19]。DCs在攝取抗原和活化T細胞的過程中，未成熟DCs向成熟DCs轉(zhuǎn)化，并且其功能與成熟相關(guān)。DCs成熟過程中發(fā)生了一系列的變化，如形態(tài)發(fā)生改變、MHC II類分子和共刺激分子CD86等的高表達，而未成熟的DC只表達很少量的MHC II和CD86[20]以及分泌影響初始型T細胞分化方向的細胞因子[21-22]。對于L. casei EPS在促進未成熟DCs向成熟DCs轉(zhuǎn)化方面的研究鮮見報道，也鮮見其誘導成熟后的DCs分泌與T細胞向輔助性T細胞（helper T cell，Th）17分化增殖相關(guān)的細胞因子的研究報道。

本研究通過流式細胞法檢測L. casei EPS處理后體外培養(yǎng)的小鼠未成熟BMDCs表面表達MHC II和CD86的情況，研究L. casei EPS對體外培養(yǎng)的小鼠BMDCs促成熟的作用，用酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法分析不同劑量的EPS對BMDCs分泌與Th17細胞分化和增殖相關(guān)的細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-23的影響，為進一步探討L. casei EPS通過影響DCs分泌細胞因子來影響初始型T細胞的分化方向提供依據(jù)。最后，用CCK-8法檢測混合培養(yǎng)體系中異基因淋巴細胞的增殖率，研究L. casei EPS對BMDCs抗原提呈能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

BALB/c小鼠（使用許可證號：SYXK（滬）2017-0014），6～8 周齡，雌性，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，由北京維通利華公司提供。

干酪乳桿菌（編號為ATCC393TM），購自美國種質(zhì)保藏中心。

RPMI 1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Gibco公司；重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子細胞因子（recombinant mouse granulocyte macrophagecolony stimulating factor，rmGM-CSF）、重組小鼠IL-4（recombinant mouse IL-4，rmIL-4）、小鼠細胞因子ELISA試劑盒（IL-6、TGF-β和IL-23） 美國R & D Systems公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）美國Sigma公司；熒光單克隆抗體（PE-CD11c、FITC-MHC II和FITC-CD86） 美國eBioscience公司；CCK-8試劑盒 合肥Biosharp公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY公司；ZFQ85B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海醫(yī)械專機廠；真空冷凍干燥機 德國Christ公司；BCD-518WSA型低溫冰箱 青島海爾集團；EPICS XL流式細胞儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 L. casei EPS的制備

干酪乳桿菌按3%接種量，接種在脫脂乳培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)26 h后，將發(fā)酵液置于沸水浴中煮沸10 min，10 000×g、4 ℃離心20 min，去除細菌和變性蛋白沉淀。向發(fā)酵液上清液中加入三氯乙酸至終質(zhì)量濃度為4 g/100 mL ，4 ℃下攪拌12 h后，10 000×g、4 ℃離心20 min，去除變性蛋白，收集上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.9 kPa和65 ℃條件下將上清液濃縮至原體積的1/4。向濃縮上清液加入2 倍體積的冷無水乙醇，在4 ℃下靜置12 h后，離心去上清液，得到乙醇沉淀后的多糖。將收集到的多糖產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋（分子質(zhì)量7 000～14 000 Da）內(nèi)，將透析袋浸入到去離子水中，每8 h換水一次，持續(xù)3 d。將最終獲得的EPS溶液進行冷凍干燥，獲得凍干粉。

1.3.2 L. casei EPS中糖含量的檢測

EPS樣品中的糖含量用苯酚-硫酸法[23]測定。以標準葡萄糖濃度為橫坐標，490 nm波長處測定的OD值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。L. casei EPS樣品的測定方法同標準曲線測定，稱取0.1 mg EPS凍干粉于25 mL比色管中，準確加入蒸餾水至1.0 mL，之后加入1.0 mL 5%苯酚溶液及2.5 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置10 min，30 ℃水浴20 min后于室溫下490 nm波長處測定OD值。EPS樣品中的蛋白質(zhì)和核酸含量用分光光度計分別在280、260 nm波長處檢測。

1.3.3 骨髓來源樹突細胞的誘導

骨髓來源樹突細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）的誘導參照Inaba等[24]的方法并稍加改進。脫頸處死6～8 周的BALB/c小鼠，在體積分數(shù)75%乙醇溶液中浸泡2 min后，將其置于超凈臺的木板（已消毒）上固定，剔除后腿肌肉并剪下股骨和脛骨。在無菌條件下，用1 mL注射器吸取RPMI 1640完全培養(yǎng)基將骨髓細胞從脛骨和股骨中沖洗出，并將其打成單細胞懸液，300×g離心5 min，得到細胞沉淀。用紅細胞裂解液裂解血紅細胞，冰敷5 min，300×g離心5 min。用PBS洗滌細胞2 次后，將骨髓單細胞重懸在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并向培養(yǎng)液中添加rmGM-CSF和rmIL-4，使終質(zhì)量濃度均為20 ng/mL，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。在為期6 d的培養(yǎng)過程中，每2 d半量吸除培養(yǎng)液，丟棄未貼壁的細胞，然后補充含有rmGM-CSF和rmIL-4的新鮮培養(yǎng)基，由于未成熟DCs具有半貼壁和趨于懸浮的特性，所以在第6天收集疏松貼壁細胞即為未成熟BMDCs。

1.3.4 BMDCs的鑒定

將誘導培養(yǎng)6 d后的BMDCs在4 ℃用體積分數(shù)10%的羊血清封閉液封閉細胞表面Fc受體10 min后，細胞離心并懸浮于預冷PBS中，調(diào)整細胞濃度為1.0×106個/mL，并加入FITC標記的倉鼠抗小鼠CD11c單克隆抗體FITC-CD11c，振蕩均勻，孵育30 min，所有操作都在冰上和黑暗中進行。標記后的細胞用預冷PBS洗滌兩次，再用預冷PBS重懸，用流式細胞儀檢測。

1.3.5 EPS處理的BMDCs表面標記物CD86和MHC II的檢測

松散附著的未成熟BMDCs用無菌移液管收集，300×g離心5 min后，以細胞濃度1.0×105個/mL接種到24 孔板中，每孔中含有添加了20 ng/mL rmGM-CSF和20 ng/mL rmIL-4的1 mL 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。將BMDCs分為PBS組（陰性對照組）、EPS組（實驗組，EPS終質(zhì)量濃度100 μg/mL）和LPS組（陽性對照組，LPS終質(zhì)量濃度1 μg/mL）。將24 孔板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

孵育24 h后的細胞在冷PBS中洗滌2 次后，放在一個圓底96 孔板中，孔中含有體積分數(shù)10%山羊血清封閉液。4 ℃交互10 min后，細胞離心并懸浮于PBS，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，加入PE-CD11c、FITC-CD86和FITC-MHC II，孵育30 min?？贵w標記的所有步驟都在冰上和黑暗中進行。標記后的細胞用PBS洗滌2 次，再用預冷PBS重懸，用于流式細胞儀檢測。

1.3.6 EPS處理的BMDCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23的檢測

未成熟BMDCs用添加了20 ng/mL rmGM-CSF和20 ng/mL rmIL-4的含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，以濃度1.0×105個/mL接種到24 孔板中。將BMDCs分為PBS組（陰性對照組）、EPS組（實驗組，EPS終質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL）和LPS組（陽性對照組，LPS終質(zhì)量濃度1 μg/mL）。24 孔板在37 ℃和5% CO2中孵育24 h。

將孵育后的24 孔板中的細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌管中，300×g離心20 min后，收集上清液用于細胞因子的檢測。如未及時檢測，將細胞上清液于-80 ℃凍存直至使用。細胞因子IL-6、TGF-β和IL-23的濃度檢測采用ELISA試劑盒，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。反應終止后，使用酶標儀在450 nm波長處檢測OD值，再根據(jù)標準曲線確定細胞因子的濃度。

1.3.7 EPS對淋巴細胞增殖影響的測定

脫頸處死BALB/c小鼠，無菌條件下取脾，制備成脾單細胞懸液，用紅細胞裂解液裂解血紅細胞后，加入淋巴細胞分離液，300×g離心30 min，將分離出的脾淋巴細胞重懸在RPMI 1640培養(yǎng)基中，0.4%臺盼藍檢測細胞活力，當細胞存活率大于95%時，調(diào)整細胞密度至2.0×105個/mL，獲得用于接種的淋巴細胞懸液。向1.3.3節(jié)分離誘導出的未成熟BMDCs中加入絲裂霉素C以去除細胞增殖活性，調(diào)整經(jīng)處理的BMDCs細胞濃度至2.0×105個/mL，作為刺激細胞和淋巴細胞懸液共同接種于96 孔板中，細胞接種量為每孔50 μL BMDCs和50 μL淋巴細胞懸液。將接種的細胞混合后，分為PBS組（陰性對照組）、不同劑量的EPS組（實驗組，EPS終質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL）和LPS組（陽性對照組，LPS終質(zhì)量濃度1 μg/mL），每組設(shè)6 個復孔。96 孔板在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育72 h后，向每孔中加入20 μL CCK-8溶液，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測OD值，按下式計算淋巴細胞增殖率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖純度的測定分析

葡萄糖標準曲線的回歸方程為y＝-0.016 6+8.92x（R2＝0.999 54）。490 nm波長處測得0.1 mg/mL EPS樣品溶液的OD值，將其代入葡萄糖標準曲線回歸方程中，得出0.1 mg/mL EPS樣品溶液中總糖質(zhì)量濃度為（0.095 02±0.001 46）mg/mL，可以推算出1 mg EPS凍干粉中的總糖質(zhì)量為（0.950 2±0.014 6）mg，即L. casei EPS純度可達95%。紫外分光光度計檢測EPS中蛋白質(zhì)和核酸含量，發(fā)現(xiàn)在280、260 nm波長處沒有吸收，表明EPS樣品中蛋白質(zhì)、核酸的含量極少，說明純化的EPS在研究中的活性作用不受蛋白質(zhì)和核酸的影響。

2.2 誘導出BMDCs的鑒定

CD11c是小鼠DCs的特征性表面分子，通過檢測CD11c的表達量，可以間接反映出誘導的BMDCs的數(shù)量。由圖1可知，流式細胞儀分析出的表達CD11c的細胞數(shù)量約占80%，表明通過骨髓造血干細胞分化出的未成熟DCs數(shù)量約占80%。

圖 1 表達CD11c的BMDCs細胞數(shù)量Fig. 1 Number of BMDCs expressing CD11c

2.3 EPS對BMDCs成熟的影響

成熟的DCs表面能表達大量的MHC II類分子和共刺激分子，如CD86，而未成熟DCs只能少量表達這些分子。MHC II類分子和共刺激分子CD86是DCs識別和攝取抗原必要的信號轉(zhuǎn)導，也是DC免疫功能的最佳指標。

2.3.1 EPS對BMDCs表達MHC II的影響

如圖2所示，PBS組的DCs表面MHC II類分子的表達量為63.8%，而100 μg/mL EPS組和LPS組的表達量分別為68.1%和70.2%。結(jié)果表明，EPS能顯著增加DCs表面MHC II分子的表達（P＜0.05），并且EPS組的MHC II分子表達量低于LPS組。證明EPS能夠促進BMDCs表面表達更多的MHC II類分子，EPS對BMDCs的成熟有促進作用。并且DCs刺激初始型T細胞活化和增殖的一個信號是通過MHC-抗原肽復合物和TCR的相互作用來傳遞的[25]，因此可以推斷出，EPS對于DCs刺激初始T細胞活化和增殖也有相應的促進作用。

圖 2 流式細胞術(shù)分析分別用PBS(A)、EPS（B）和LPS（C）處理后的BMDCs表面MHC II的表達量（D）Fig. 2 Expression of MHC II (D) on the surface of BMDCs treated with PBS (A), EPS (B) or LPS (C) evaluated by fl ow cytometer

2.3.2 EPS對BMDCs表達CD86的影響

圖 3 流式細胞術(shù)分析分別用PBS（A）、EPS（B）和LPS（C）處理后的BMDCs表面CD86的表達量（D）Fig. 3 Expression of CD86 (D) on the surface of BMDCs treated with PBS (A), EPS (B) or LPS (C) evaluated by fl ow cytometer

如圖3所示，PBS組的DCs表面共刺激分子CD86的表達量為68.5%，而100 μg/mL EPS組和LPS組的表達量分別為74.3%和75.1%。結(jié)果表明，EPS能提高DCs表面共刺激分子CD86的表達（P＜0.05），并且EPS組CD86的表達量低于LPS組。證明EPS能夠促進BMDCs表面表達更多的CD86分子，EPS對BMDCs的成熟有促進作用。DCs刺激初始T細胞活化和增殖的一個信號是共刺激信號，通過DCs上的CD80/CD86和T細胞上的CD28的相互作用來傳遞[23]，因此可以推測EPS對于DCs刺激初始T細胞活化和增殖也有相應的促進作用。

2.4 EPS對DCs分泌與Th17細胞分化增殖相關(guān)的細胞因子的影響

圖 4 EPS對DCs分泌與Th17細胞分化增殖相關(guān)的細胞因子IL-6（A）、TGF-β（B）和IL-23（C）的影響Fig. 4 Effect of EPS on cytokine secretion of DCs, IL-6 (A), TGF-beta (B)and IL-23 (C) associated with differentiation and proliferation of Th17 cells

在小鼠模型中，促炎細胞因子IL-6和TGF-β能促進Th17細胞分化，IL-6和TGF-β可作為誘導CD4+T細胞分化為Th17細胞的起始因子[26]。許多研究表明，IL-23的缺乏并不影響T細胞向Th17細胞的分化，這意味著IL-23不在初始CD4+T細胞發(fā)揮作用，它只是促進Th17細胞的增殖，所以認為IL-23是Th17細胞生存和增殖的關(guān)鍵因素[27]。

由圖4A可知，當EPS質(zhì)量濃度為12.5～200 μg/mL時，均能夠顯著促進BMDCs表達IL-6，EPS組的IL-6表達量分別為（93.18±0.62）、（96.21±0.62）、（100.51±1.56）、（101.77±0.94）、（104.55±0.62）ng/L，與PBS組表達量（40.66±1.89）ng/L相比具有極顯著性差異（P＜0.01），并且IL-6表達量與EPS的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當EPS質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，IL-6的表達量最多。值得注意的是，EPS組與LPS組（（107.50±1.24）ng/L）相比，IL-6的表達量顯著減少（P＜0.05）。

由圖4B可知，當EPS質(zhì)量濃度為12.5～200 μg/mL時，均能夠極顯著促進B M D C s分泌T G F-β，EPS組的TGF-β表達量分別為（87.56±1.00）、（91.63±0.57）、（92.85±2.87）、（99.35±1.52）、（104.23±2.51）ng/L，各EPS組表達量與PBS組（（61.95±1.99）ng/L）相比均有極顯著差異（P＜0.01），并且EPS質(zhì)量濃度與促進BMDCs分泌TGF-β的量呈正相關(guān)，當EPS質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，TGF-β的表達量最多。LPS組TGF-β表達量為（115.05±1.49）ng/L，EPS組與之相比，TGF-β的表達量極顯著減少（P＜0.01）。

由圖4C可知，當EPS質(zhì)量濃度為12.5～200 μg/mL時，均能夠極顯著促進B M D C s分泌I L-2 3，EPS組IL-23表達量分別為（152.22±2.58）、（1 5 2.7 3±3.7 1）、（1 5 9.3 0±3.7 8）、（163.84±1.43）、（168.38±3.78）pg/mL，與PBS組的表達量（82.53±3.78）pg/mL相比差異極顯著（P＜0.01），并且IL-23表達量與EPS質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當EPS質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，IL-23的表達量最多。值得注意的是，EPS組與LPS組IL-23的分泌量（179.22±1.20）pg/mL相比，IL-23的表達量極顯著減少（P＜0.01）。

以上結(jié)果表明，一定質(zhì)量濃度的EPS能夠促進DCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23，并且呈劑量依賴性，說明EPS可以通過促進DCs分泌IL-6和TGF-β來促進初始T細胞向Th17細胞方向分化，分泌IL-23促進Th17細胞的增殖。

2.5 EPS影響B(tài)MDCs對異基因淋巴細胞增殖的刺激作用

表 1 EPS對脾淋巴細胞增殖的影響Table 1 Effect of EPS on the proliferation of mouse splenic lymphocytes

EPS通過BMDCs的刺激誘導異基因淋巴細胞的增殖，進而能夠反映EPS對BMDCs抗原提呈能力的影響。如表1所示，EPS質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL實驗組的淋巴細胞增殖率與陰性對照組相比顯著增多（P＜0.05），與陽性對照組相比顯著減少（P＜0.05），表明EPS提高了異基因淋巴細胞的增殖能力，說明EPS能夠增加BMDCs的抗原提呈能力。

實驗組的淋巴細胞增殖率隨著EPS質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，但是50 μg/mL EPS與25 μg/mL EPS組的淋巴細胞增殖率相比未顯著增加，25 μg/mL EPS與12.5 μg/mL EPS組的淋巴細胞增殖率相比未顯著增加，而100 μg/mL EPS和200 μg/mL EPS組與其他實驗組的淋巴細胞增殖率相比增加顯著（P＜0.05），但是這兩個實驗組的淋巴細胞增殖率相比沒有顯著性差異，表明100、200 μg/mL EPS更有利于淋巴細胞增殖，且促進效果相當。

3 討 論

DCs發(fā)揮抗原提呈功能和啟動體外免疫調(diào)節(jié)與其是否成熟密切相關(guān)，MHC II分子和CD86是成熟DCs的標志物，也是活化T細胞的兩個必要因素，在激發(fā)免疫反應中起著不可或缺的作用[25]。本研究結(jié)果表明，L. casei EPS能夠促進DCs表面MHC II分子和CD86的表達，說明EPS可能導致DCs的成熟，也可以進一步推測EPS可能通過增強DCs抗原呈遞能力來促進T細胞的活化，進而影響T細胞的分化和增殖。

在2005年，Th17細胞作為區(qū)別于Th1和Th2型細胞的第3種效應性Th細胞亞群被發(fā)現(xiàn)，Th17細胞在組織炎癥和自身免疫性疾病發(fā)生的過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[28-29]。DCs可以通過分泌不同的細胞因子來介導T細胞的活化，其中DCs分泌的IL-6、TGF-β和IL-23可以誘導T細胞向Th17細胞的分化和增殖[21-22]。本研究結(jié)果表明，L. casei EPS能夠促進DCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23，說明EPS可能通過促進DCs分泌與向Th17細胞分化相關(guān)的必要細胞因子來誘導T細胞向Th17的分化和增殖。而DCs通過分泌不同細胞因子來介導T細胞分化的方向是DCs成熟之后功能性的表達之一，進一步驗證出EPS對于DCs成熟的促進作用。

DCs刺激淋巴細胞增殖可以反映出其抗原提呈能力，DCs的提呈抗原能力隨其發(fā)育成熟而逐步增強，因此，可以通過淋巴細胞的增殖率來反映出DCs的成熟狀態(tài)[30]。本研究結(jié)果表明，L. casei EPS能夠使BMDCs對異基因淋巴細胞的增殖產(chǎn)生明顯刺激作用，進一步驗證出EPS能夠增強BMDCs的抗原提呈能力，并能誘導其成熟，同時刺激淋巴細胞增殖能力增強，進而影響細胞免疫。

LPS是一種常見的內(nèi)毒素，它能夠使細胞產(chǎn)生強烈的免疫反應或損害，通常在研究中設(shè)計為陽性對照[15-16]。本研究結(jié)果表明，干酪乳桿菌EPS對BMDCs表面MHC II分子和CD86以及分泌的細胞因子的表達量的影響均比LPS較小，并且對BMDCs刺激淋巴細胞增殖的能力小于LPS，說明EPS能夠適度地調(diào)節(jié)DCs免疫反應。

綜上所述，在體外實驗中，L. casei EPS對BMDCs具有誘導成熟的效應活性，能夠增加BMDCs表面MHC II分子和CD86的表達，促進BMDCs分泌與Th17分化和增殖相關(guān)的細胞因子IL-6、TGF-β和IL-23，并且可以促進BMDCs的抗原提呈能力，刺激淋巴細胞增殖，但是L. casei EPS通過影響DCs分泌細胞因子來影響初始T細胞的分化方向，以及涉及的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路與分子機制還有待進一步驗證。