邱濤濤，徐振林，甘慶慶，王蘭騰，沈 興，李向梅，孫遠明，雷紅濤*

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

在食物和飼料中針對性地添加營養(yǎng)成分物質是降低毒素誘發(fā)危害的有效措施之一。卵黃免疫球蛋白（egg yolk immunogolbulin，IgY）又稱卵黃抗體，是從特定抗原免疫禽類蛋黃中提取的抗體，與哺乳動物血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）具有相同特性，能與抗原特異性識別結合，但又不同于IgG，IgY不與細菌或哺乳動物的受體Fc結合，且不激活補體系統(tǒng)[1]。IgY來源方便、無需采血且無損傷，符合動物福利原則，具備成本低、易貯藏、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢[2-3]；所以歐洲替代方法驗證中心建議以IgY代替哺乳動物IgG作為生產(chǎn)抗體的來源。如今，IgY以其具有的生物學特點和應用方面的優(yōu)勢，已經(jīng)應用于嬰幼兒食品和牲畜飼料中，用于抵抗病毒和細菌性疾病的侵害[4]。另對IgY的研究發(fā)現(xiàn)，其還可以有效識別大分子蛋白毒素如蛇毒、細菌外毒素等，起到中和毒素、降低毒性的作用[5-6]。本文就IgY體內代謝和中和毒素的研究近況做簡要闡述，以期為脫除食品和飼料中毒素提供新的思路。

1 IgY的形成和結構

禽類通過法氏囊控制體液免疫系統(tǒng)，當受到外界特異性抗原（尤其是滅活抗原）的刺激后，經(jīng)體液免疫，在法氏囊內激活B細胞，激活的B細胞分化為漿細胞并分泌特異性抗體進入血液循環(huán)。當血液流經(jīng)卵巢時，血液中的特異性抗體（IgG）主要在卵黃中蓄集起來，形成IgY[7-8]。如圖1A所示，IgY由兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）組成，分子質量約為180 kDa，重鏈分子質量為62～67 kDa，輕鏈為22～25 kDa，抗原結合片段（fragment antigen binding，F(xiàn)ab）部分分子質量約為45 kDa。如圖1B所示，完整型IgY的重鏈由一個可變區(qū)（VH）和4 個恒定區(qū)（CH1、CH2、CH3、CH4）組成，由于其鉸鏈區(qū)與IgG氨基酸序列不同，鉸鏈區(qū)相對較短且柔性差；輕鏈由一個可變區(qū)（VL）和一個恒定區(qū)（CL）組成；抗體中的Fc片斷是主要的疏水基團[9]。IgY和IgG的分子結構見圖1[10]。對IgG和IgY分子恒定區(qū)氨基酸比對顯示，IgG分子中Cγ2和Cγ3區(qū)分別與IgY分子中CH3和CH4具有很高的同源性[11]。Helm等[12]發(fā)現(xiàn)IgY的CH1—CH2和CH3—CH4之間有一段脯氨酸和甘氨酸殘基區(qū)域，此區(qū)域能使IgY分子具有一定的可折疊性，并認為這個區(qū)域與IgY的功能形成有關。

圖 1 IgY（A）和IgG（B）分子結構[10]Fig. 1 Molecular structures of IgY (A) and IgG (B)[10]

2 IgY的提取與純化

綜合經(jīng)濟性和可操作性考慮，多采用肌肉注射或胸部皮下多次注射兩種急性方式免疫蛋雞，初次免疫后200 d或整個產(chǎn)蛋期均能獲得有效價的IgY[1]。目前廣泛適用的IgY提取純化方法往往受限于純化步驟，而卵黃中的脂質和脂蛋白對純化影響最大。IgY的初始提取步驟應盡量除去脂質和脂蛋白[13]，現(xiàn)有商業(yè)化和實驗中常用去脂方法包括有機溶劑提取法、鹽析法、有機溶劑及有機物沉淀法、層析法、凍融法、膜過濾法和酸性條件下水稀釋法[14]。提取后再經(jīng)鹽析法、凝膠過濾層析法、膜過濾法和離子交換層析法等進一步純化[15]。不同的提取和純化方法得到的IgY產(chǎn)量、純度和活性亦不相同，有機溶劑提取法產(chǎn)率較高，但因上清液中有殘留，對抗體活性有影響，同時有機溶劑造成的環(huán)境污染嚴重，此方法僅適合實驗室少量制備；鹽析法和沉淀法簡單、經(jīng)濟，但提取的IgY純度低；層析法能得到高純度的特異性IgY，但因產(chǎn)率低、費用高而不能大規(guī)模應用，僅適用于科研；凍融法回收率偏低；膜過濾法成本偏高；水稀釋法具有工藝簡便、生產(chǎn)成本較低和回收率高等優(yōu)點，比較適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在實際制備純化過程中，應優(yōu)化組合各種提取、純化和濃縮方法，使方法盡量經(jīng)濟、簡便，且產(chǎn)率和活性高。

3 IgY體內代謝活性研究

3.1 IgY活性影響因素

3.1.1 IgY的酸穩(wěn)定性

IgY等電點在5.7～7.6之間，其在pH 4.0～11.0時穩(wěn)定。在酸性條件下（pH 3.0～3.5）活性下降，且IgY的活性較其他抗體下降更快。通過色氨酸自然熒光變化跟蹤酸性環(huán)境對抗體立體結構的影響，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，IgY比其他抗體更容易產(chǎn)生立體結構變化[16]。

3.1.2 IgY對酶的敏感性

在胃腸道消化過程中，IgY能抵抗胃腸道中胰蛋白酶和胰凝乳酶的分解，而胃蛋白酶和糜蛋白酶對其作用明顯，能特異性降低IgY的活性。pH值在2.0以下時，IgY在胃蛋白酶作用下易失去活性；在pH 4.0的酸性條件下，胃蛋白酶作用4 h后IgY活力下降50%；而如果僅用胃蛋白酶酶解24 h，酶解片段仍具有抗體活性，保持中和抗原的特性；酸性條件對胃蛋白酶降低IgY活性影響較大，堿性（重碳酸鈉鹽）和高濃度蛋白質溶液能增加IgY抗酸和抗蛋白酶水解能力[17]。

3.1.3 IgY的熱穩(wěn)定性

低溫狀態(tài)下，IgY在4 ℃條件下能夠貯存5 年，室溫下能夠存放6 個月，抗體活性不會發(fā)生變化[18]。高溫狀態(tài)下，通常IgY熱穩(wěn)定性的上限是60 ℃，當加入其他輔助試劑時，例如質量分數(shù)30%的蔗糖、海藻糖或乳糖，其耐熱上限可以達到70 ℃。用胃蛋白酶酶解制備的活性片段Fab’在溫度為65 ℃條件下加熱15 min，結合抗原活性未發(fā)生改變；在低pH值和高鹽濃度條件下，F(xiàn)ab’的活性也未受影響，說明Fab’的熱、酸堿穩(wěn)定性和對鹽離子濃度的耐受性均高于IgY[19]。

3.1.4 IgY的沉淀和凝集作用

IgY僅在一定的鹽濃度環(huán)境中產(chǎn)生沉淀反應。這可能與IgY的空間構象有關，IgY的兩個Fab片段太靠近以致難以與兩個大抗原結合，當在一定的鹽濃度和酸性條件下，兩個Fab片段得以釋放，出現(xiàn)沉淀反應。在鹽的誘導下，由Fc段介導的抗原抗體聚集反應原理尚不清楚，推測IgY的兩個Fab’片段的CH2區(qū)可能與聚集作用的發(fā)生有關，另外碳水化合物殘基閉合抗原結合位點，可導致其失去凝集抗原的能力[20]。

3.2 口服IgY體內代謝活性研究

IgY在疾病治療上的作用極大延伸了抗體應用范圍。雖然利用口服方式發(fā)揮治療作用的確切機制尚不清楚，但其根本是基于抗體抗原的相互作用[21]。蛋白質或多肽經(jīng)口服以后，往往會在胃中較低pH值條件下被蛋白酶降解，形成小的片段被腸道吸收或失活。不同的研究發(fā)現(xiàn)嬰兒和成人口服IgG后，其糞便仍然有19%～50%的抗體具有活性[22]。Reilly等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，IgY在腸道中呈現(xiàn)出較其他抗體更強的耐受性，因此其在口服應用上具有一定的優(yōu)勢；且因其高特異性，口服IgY對細菌或病毒引起的非消化道和全身性疾病有顯著的控制作用[24]。Yokoyama等[25]用質量濃度為100 mg/mL的抗-K88g IgY分別喂食不同日齡幼齡仔豬5 mL，檢測飼喂后0、2、6、24 h抗-K88g IgY在幼齡仔豬血液和胃腸道中的分布情況，檢測結果顯示，幼齡仔豬未成熟的胃腸道環(huán)境不能破壞IgY活性，IgY能被胃腸道吸收轉運至循環(huán)系統(tǒng)，其在血液中的半衰期為1.85 d。成熟機體攝入IgY后，因IgY不與細菌或哺乳動物的受體Fc結合，完整IgY不被機體所吸收[26]。在胃酸性條件下，IgY經(jīng)胃蛋白酶和糜蛋白酶分解，部分失去活性，其余部分以活性片段（如：Fab和Fab’）和完整分子結構形式存在。少量活性片段經(jīng)胃腸道吸收進入血液，在血液循環(huán)的帶動下到達病灶處與病原菌結合，發(fā)揮其免疫學活性[27]。未被吸收的部分IgY在腸道中可有效抑制細菌的定植、增殖及分泌毒素，最后排出體外；因此，可以預期IgY經(jīng)口攝入后，不會對人體系統(tǒng)產(chǎn)生危害影響[28]，且能保持部分活性，發(fā)揮其對特定抗原的抑制作用。為更好增強IgY的口服穩(wěn)定性，延緩IgY的釋放，提高其生物利用度，國內外研究者采用混合添加劑法、多糖修飾法和包埋法等增強IgY對胃酸和胃蛋白酶的穩(wěn)定性[29-30]。

4 IgY中和大分子蛋白毒素研究

4.1 IgY中和蛇毒研究

據(jù)統(tǒng)計，全世界現(xiàn)有3 000余種蛇類，約650 種毒蛇，而這其中有近300 種毒蛇對人體有致命危險[31]。蛇毒是毒蛇的毒腺中分泌的一種天然的含有多種酶類、非酶類的毒性蛋白質和多肽類物質。毒蛇毒液注入人體后可引起外周神經(jīng)毒、凝血障礙、肌肉毒性和腎功能衰竭；部分成分能誘發(fā)神經(jīng)毒性、心臟毒性和組織壞死毒性而呈現(xiàn)致命性[32]。蛇毒的危害是全世界熱帶和亞熱帶地區(qū)主要公共衛(wèi)生問題[33]?，F(xiàn)在世界范圍內主要通過注射動物源性抗蛇毒血清以中和蛇毒治療蛇傷，其策略就是用抗體抗原結合中和蛇毒?？贵w能與毒素形成復合物，改變活性蛇毒分子生物利用度，或利用抗體和抗原的結合干預毒素與受體的相互作用，達到抑制毒素毒性的作用[34]。1990年Thalley等[35]首次報道制備的抗蛇毒IgY能有效中和蛇毒對實驗小鼠的致死毒性，其中和能力是商用馬源型抗體的6.3 倍，IgY對蛇毒表現(xiàn)出很好的中和效果。近年來，研究者們已經(jīng)開始研究用IgY替代針對不同種屬蛇毒的抗蛇毒血清，研究結果見表1。由此可見，用蛇毒免疫蛋雞可獲得高活性的抗蛇毒IgY，它不僅能有效中和蛇毒的致死效應，也能中和蛇毒引起的多種毒理學效應。此外，卵黃中抗蛇毒IgY含量高，據(jù)報道，18 只免疫的雞每年能夠產(chǎn)出的抗蛇毒血清與1 匹馬的產(chǎn)出量相當[34]。因此，IgY被認為是一種可能替代抗蛇毒血清的新型蛇毒解毒劑。

表 1 IgY對蛇傷治療的相關研究Table 1 Related applications of IgY against snake bites

4.2 IgY中和其他蛋白毒素研究

自然界許多動物、植物和細菌都能產(chǎn)生大分子蛋白毒素。大分子蛋白類毒素很難直接跨膜進入細胞，需通過內化由細胞膜外進入細胞，進而作用不同靶位發(fā)揮毒性作用，此過程往往借助受體完成，是蛋白毒素中毒的關鍵步驟[45]。利用IgY中和毒素的研究，目前大多限于大分子毒素。Leclaire等[46]用葡萄球菌分泌的腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）的兩個重疊片段免疫蛋雞產(chǎn)生IgY，該IgY可抑制被動免疫小鼠的細胞因子反應，使小鼠產(chǎn)生免疫保護力；且能使被動免疫的恒河猴在含有致命劑量SEB的氣霧里存活4 h，對恒河猴起到一定的保護作用。陳翠萍等[47]采用幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）超聲裂解物和該菌培養(yǎng)液離心上清液濃縮后免疫蛋雞制備IgY，兩種抗體均能中和Hp毒素，可降低Hp蛋白抗原對Vero細胞的毒性作用；感染小鼠經(jīng)抗Hp-IgY口服治療4 周后，其陰轉率達100%，且肝臟病理切片顯示炎癥明顯減輕。Pauly等[48]采用蓖麻毒素免疫蛋雞得到高效價和特異性IgY，體外實驗顯示抗蓖麻毒素IgY能預防蓖麻毒素誘導Vero細胞死亡；體內實驗用抗體與毒素室溫孵育30 min的復合物注射BALB/c鼠，IgY與毒素復合物處理組大鼠存活率較毒素處理組升高。近幾年，較多研究采用大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素免疫蛋雞制備IgY，探究其降毒效應和解毒機制。de Almeida等[49]采用大腸桿菌J5株、內毒素與類脂混合免疫蛋雞制備IgY，該抗體效價高、特異性強，防治內毒素血癥效果明顯。此后，Wang Qin等[6]用志賀毒素亞型蛋白（StxB）免疫蛋雞獲得抗StxB-IgY，并采用體內和體外實驗研究抗StxB-IgY降低StxB毒性的作用，發(fā)現(xiàn)抗StxB-IgY能阻斷StxB與HeLa細胞膜上受體的結合，使共同孵育處理的HeLa細胞存活率增加；通過動物實驗發(fā)現(xiàn)該抗體能降低Stx1對BALB/c鼠的毒性損傷。Parma等[50]用志賀毒素蛋白（Stx2）免疫蛋雞獲得抗體Stx2-IgY，中和毒性效應顯示該抗體能很好地識別結合Stx2毒素，有效降低Stx2對Vero細胞的毒性，并且灌胃和注射IgY的方式可減輕Stx2對大鼠的毒性損傷。Neri等[51]用志賀毒素亞型蛋白（Stx1B和Stx2B）和兩種毒素亞型重組體蛋白（rStx1B和rStx2B）免疫蛋雞，得到相應的抗Stx1B-IgY、抗Stx2B-IgY、抗rStx1B-IgY和抗rStx 2B-IgY，研究結果表明重組蛋白免疫的抗體特異性強，不存在交叉識別，中和能力較原抗體分別增強10 倍和2.6 倍。體外實驗結果顯示，直接采用大分子蛋白毒素免疫蛋雞獲得的IgY，具備抗體與抗原特異性結合的特性，IgY能與大分子蛋白毒素結合在一起，阻斷蛋白毒素與細胞表面的受體結合，減少細胞對毒素的攝入，起到對細胞的保護作用[52]（圖2）。

圖 2 IgY中和蛋白毒素誘發(fā)的細胞毒性機制Fig. 2 diagram of the mechanism of IgY for reducing macromolecular protein toxins-induced cytotoxicity

5 應用前景

近十年來，脫除食品和飼料中毒素（特別是真菌小分子毒素）的方法主要包括：物理吸附法，化學法和生物酶解毒法[53]，然而這些方法存在穩(wěn)定性差、易導致營養(yǎng)物質損失、產(chǎn)生次生有毒物質、成本較高和運輸條件苛刻等問題[54]。因此，利用新型生物技術開發(fā)穩(wěn)定高效、無副作用以及環(huán)境友好的脫除方法是毒素脫除的一個重要發(fā)展方向。綜上所述，IgY中和大分子蛋白毒素作用明顯，相較于哺乳動物IgG，IgY的生產(chǎn)成本低、純化工藝簡單、產(chǎn)量大且穩(wěn)定性好，引發(fā)副作用的可能性低，IgY是一種極富前景的中和毒素資源。盡管如此，目前的研究主要集中于降低大分子蛋白毒素毒性，自然界還存在種類繁多的小分子毒素，小分子毒素污染源廣、毒性強，但目前鮮有IgY對小分子毒素中和作用的研究。因此，利用IgY的生物學優(yōu)勢和體內代謝特點，探索其對小分子毒素的降毒效應與解毒機制，能為開發(fā)生物友好的小分子毒素脫除方法提供一個嶄新的思路。另外，IgY因其具有的生物學特點和開發(fā)應用方面的優(yōu)勢，已經(jīng)作為添加劑應用于嬰幼兒食品和牲畜飼料，用于抵抗病毒和細菌性疾病的侵害。利用其口服方面的優(yōu)勢，作為食品和飼料添加劑對控制小分子毒素對公眾身體健康的影響具有重大意義?，F(xiàn)階段對于利用IgY中和毒素的研究還停留在實驗室階段，有必要推進IgY的耐受性和對人應用安全性的臨床實驗。

6 結 語

不合理的食品和飼料加工、運輸和貯藏方式易產(chǎn)生各種毒素，隨著人們對食品安全日益重視，降低食品和飼料中毒素毒性已經(jīng)成為保障公眾安全和畜禽健康的重要措施之一。IgY可有效識別大分子蛋白毒素，起到降低毒素毒性的作用。IgY作為嬰幼兒食品和動物飼料添加劑已經(jīng)得到開發(fā)應用，口服方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)越性，成為國內外開發(fā)的一種重要、安全的營養(yǎng)添加劑。隨著研究理論的不斷深入及科學技術的進步，相信利用IgY與抗原特異性識別和結合的特性及其在應用方面的優(yōu)勢，勢必能為降低食品和飼料中毒素毒性提供新的途徑。