韓少華，萬里新，李秀敏，王海玲，董金城，靳 艷，)，楊 洋,)，肖凡凱，宋 昕 ，

胡守佳1)，趙學(xué)科1)，王建坡7)，王立東1)

1) 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室；省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2) 南陽市中心醫(yī)院腫瘤科 河南南陽 473003 3) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胃腸科 河南新鄉(xiāng)453003 4) 淇縣人民醫(yī)院內(nèi)科 河南淇縣 456750 5) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 河南新鄉(xiāng)453003 6) 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室 鄭州450001 7)安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤防治辦公室 河南安陽455000

食管癌是世界上最常見的九大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下，發(fā)現(xiàn)晚和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移一直是食管癌研究的重大難題[1-2]。中國作為食管癌高發(fā)國家之一，其病理類型主要為鱗癌。E-cadherin是鈣黏附蛋白家族的成員之一，是一種細(xì)胞骨架黏蛋白，在正常上皮組織中發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞分化，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和極性等重要作用。近年來的研究[3-4]表明，E-cadherin的表達(dá)減少或丟失與腫瘤臨床病理表現(xiàn)有一定關(guān)系，然而，E-cadherin蛋白表達(dá)對(duì)食管癌預(yù)后的影響仍存在爭議。本研究利用50萬例食管癌和賁門癌臨床信息數(shù)據(jù)庫的資料，在大樣本的基礎(chǔ)上分析E-cadherin蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象從河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室50萬例食管癌和賁門癌臨床信息數(shù)據(jù)庫中選取1985年至2016年入庫的研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為食管鱗癌且經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)前均未接受過針對(duì)腫瘤的治療(化療、放療等)，臨床病理信息完整且組織標(biāo)本經(jīng)HE染色、顯微鏡觀察確認(rèn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、無壞死。排除脫片造成的不能判斷免疫組化染色結(jié)果者。入組患者5 620例，男3 652例，確診年齡(60.4±8.4)歲，女1 968例，確診年齡(61.5±8.0)歲；參考UICC/AJCC制定的第6版食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期221例,Ⅱ期2 828例,Ⅲ期2 343例,Ⅳ期228例；浸潤程度：黏膜層185例，肌層1 324例，纖維膜3 998例，纖維膜外113例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性2 568例，陰性3 052例；組織分化程度：高分化485例，中分化3 209例，低分化1 926例。

1.2食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白的檢測將入選患者蠟塊標(biāo)本中癌組織集中區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記并設(shè)計(jì)7×16微列陣，以0.15 mm直徑打孔，重新制成組織芯片模型并固定，然后進(jìn)行免疫組化染色。兔抗E-cadherin抗體(GB13083-1，1∶500)、PBS(pH 7.4)、檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)、免疫組化染色試劑盒(G1210-2)均為武漢Servicebio技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。按照試劑標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。石蠟切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇梯度脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水避光孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA血清封閉，加兔抗E-cadherin抗體4 ℃孵育過夜，加二抗(G1210-2,即用型)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以已知的陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，400倍光鏡下觀察。E-cadherin蛋白免疫陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜棕黃色顆粒狀均質(zhì)著色，細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色。結(jié)果判定采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的ABC法[5-6]。根據(jù)陽性細(xì)胞染色程度判定：無染色為0分；胞膜有淡黃色顆粒，明顯高于背景者為1分；有較多棕黃色顆粒者為2分；有大量深棕黃色顆粒者為3分。每張切片于400倍鏡下計(jì)數(shù)全部陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，<5%為0分，5%～為1分，25%～為2分，≥75%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4分以上為強(qiáng)陽性。

1.3隨訪確診后開始跟蹤隨訪，記錄患者死亡時(shí)間及死亡原因，隨訪截止時(shí)間為2018年6月8日，終點(diǎn)事件為死亡。隨訪方式有電話隨訪、走訪入戶調(diào)查、村醫(yī)及村干部問詢、腫瘤登記冊(cè)查詢等。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。不同臨床特征患者癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)的比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制不同臨床病理特征患者的生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型篩選食管鱗癌術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果見圖1。不同臨床病理特征食管鱗癌患者癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)的比較見表1、2。

A:陰性；B弱陽性；C：強(qiáng)陽性

臨床病理特征 nE-cadherin表達(dá)陰性弱陽性強(qiáng)陽性Z/H(P) 確診年齡 <60歲 ≥60歲1 8101 8423663371 0001 0594444460.700(0.482)浸潤程度 黏膜層100175825 肌層 纖維膜7882 6791465234361 5182066381.770(0.621) 纖維膜外85174721淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性 陽性1 9231 7293923111 1319284004904.618(<0.001)分化程度 高分化2954220647 中分化2 0743411 19054323.560(<0.001) 低分化1 283320663300病理分期 Ⅰ期130208624 Ⅱ期 Ⅲ期1 7791 5833662941 04185437243526.620(<0.001) Ⅳ期160237859

表2 不同臨床病理特征女性食管鱗癌患者癌組織中E-cadherin表達(dá)的比較

男性患者中，分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、病理分期高的患者E-cadherin表達(dá)強(qiáng)于分化程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、病理分期低者(P<0.05)。女性患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、病理分期高的患者E-cadherin表達(dá)強(qiáng)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、病理分期低者(P<0.05)。

2.2術(shù)后預(yù)后影響因素分析Kaplan-Meier生存分析結(jié)果見表3、表4。男性患者中，E-cadherin不同表達(dá)組間生存曲線有差異，表達(dá)越強(qiáng)，中位生存期越短。而女性患者中，E-cadherin不同表達(dá)組間生存曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Cox回歸分析變量賦值見表5?；貧w分析結(jié)果(表6、7)顯示： E-cadherin表達(dá)不是食管鱗癌女性患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.089)，但是男性患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001)。

表3 不同臨床病理特征男性食管癌患者的Kaplan-Meier生存分析

表4 不同臨床病理特征女性食管癌患者的Kaplan-Meier生存曲線的比較

表5 變量賦值表

表6 食管鱗癌男性患者 術(shù)后預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果

表7 食管鱗癌女性患者 術(shù)后預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

E-cadherin是鈣黏蛋白家族成員，是一種重要的跨膜糖蛋白，其基因位于第16號(hào)染色體，其與連接素(α、β、γ-catenin)結(jié)合形成復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，維持上皮組織結(jié)構(gòu)和功能，被認(rèn)為是細(xì)胞間黏附連接、維持細(xì)胞極性和組織完整性的重要蛋白[7]。E-cadherin表達(dá)低下導(dǎo)致的復(fù)合物功能障礙，可影響細(xì)胞間黏附。

腫瘤細(xì)胞分化程度降低，則極性喪失，細(xì)胞間連接減弱，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin表達(dá)與食管鱗癌的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是Luo和Siitonen等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)某些生物標(biāo)記物在原發(fā)腫瘤和配對(duì)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)并不一致，E-cadherin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)強(qiáng)于原發(fā)腫瘤組織。因此腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

研究[11-13]證實(shí)，E-cadherin和連接素的共同作用與食管癌的預(yù)后相關(guān)。Ishiguro等[3]則認(rèn)為癌組織中β-catenin的表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后無關(guān)，而E-cadherin與β-catenin則協(xié)同起作用，影響食管癌患者的預(yù)后。因此，目前人們對(duì)E-cadherin表達(dá)評(píng)判食管癌預(yù)后的價(jià)值看法不一。本研究利用大樣本、長時(shí)間隨訪數(shù)據(jù)，對(duì)癌組織中E-cadherin表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存狀況的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，E-cadherin陽性表達(dá)是男性食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但不是女性患者的術(shù)后預(yù)后影響因素。多項(xiàng)研究[14-16]結(jié)果顯示，女性食管鱗癌患者的術(shù)后生存狀況優(yōu)于男性，這一現(xiàn)象可能與女性體內(nèi)激素水平、受體水平、婚育狀態(tài)有關(guān)。

分子生物學(xué)指標(biāo)是精準(zhǔn)預(yù)防、精準(zhǔn)治療、個(gè)體化治療的必然條件。本研究結(jié)果提示E-cadherin是男性食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立影響因素，但其分子機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。此外單一指標(biāo)能否對(duì)預(yù)后做出準(zhǔn)確的判斷，也值得進(jìn)一步探討。