丘文苑 林 笛 林悅芹 謝彩霞 藍(lán)菲瑩 謝龍鳳 羅 權(quán) 張錫寶

麻風(fēng)在組織學(xué)上以肉芽腫為特征，其反映著機(jī)體的免疫狀態(tài)。在麻風(fēng)患者中同時(shí)存在細(xì)胞免疫和體液免疫，但以細(xì)胞免疫為主[1,2]。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞屬于T淋巴細(xì)胞亞群，也叫抑制性T淋巴細(xì)胞，通過分泌具有下調(diào)作用的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、免疫耐受、免疫抑制作用。而IL-10在Treg細(xì)胞的分化及功能方面起著作用。目前，已有研究表明在麻風(fēng)患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及血清IL-10比正常人明顯增多[3,4]。但對(duì)麻風(fēng)愈合的免疫狀況研究卻很少，我們通過檢測(cè)麻風(fēng)康復(fù)者外周血清中Treg細(xì)胞、IL-10，探討Treg細(xì)胞、IL10在麻風(fēng)康復(fù)者體內(nèi)的免疫狀況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本組患者為廣東省泗安醫(yī)院住院部休養(yǎng)員，共25例，其中男17例，女8例，年齡61～88歲，平均73.45歲，臨床上均治愈。并選取同年齡層的健康志愿者20名為對(duì)照組，要求血清學(xué)及肝腎功能檢查正常，排除感染結(jié)核、麻風(fēng)、HBV、HCV、腫瘤及患自身免疫系統(tǒng)疾病的人群。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 IL-10檢測(cè)試劑盒(深圳達(dá)科)、RT-6000酶標(biāo)分析儀、PerCP-抗人CD4 抗體、FITC-抗人CD25 抗體、PE-抗人Foxp3抗體、同型對(duì)照FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1、人Foxp3 BufferSet、緩沖液Stain Buffer(FBS)(美國(guó)Becton-Dickinson公司)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 抽取每個(gè)實(shí)驗(yàn)者及對(duì)照組患者各2管5 mL肝素抗凝血。分離出其中1管的外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至2×107個(gè)/mL。分為空白管、CD25同型對(duì)照管、CD4CD25管、Foxp3同型對(duì)照管、CD4CD25Foxp3管，在各管中加入100 μL細(xì)胞懸液。①分別在各管中加入CD4、CD25抗體，空白管不加抗體，充分混勻，4℃避光孵育30 min；②各管加入染色劑2 mL,1500 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌2次，棄上清液；③各管加入穿膜劑1 mL,4℃避光孵育30 min,再加入穿膜緩釋劑2 mL,1200 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌2次，棄上清液；④在空白管中、CD25同型對(duì)照管、CD4CD25管中加入染色緩沖劑，充分混勻，避光待測(cè);⑤Foxp3同型對(duì)照管、CD4CD25Foxp3管加入Foxp3抗體，混勻，4℃避光孵育30 min。再加入穿膜劑1 mL,4℃避光孵育30 min,；加入穿膜緩釋劑2 mL,1200 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌2次，棄上清液。最后加入染色緩沖劑;⑥將各管全部拿出上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 Treg細(xì)胞檢測(cè) 按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法，先上空白管，調(diào)節(jié)電壓，并以CD25同型對(duì)照調(diào)節(jié)補(bǔ)償，確定CD4+CD25+細(xì)胞群，再以CD4+CD25+細(xì)胞設(shè)門，以Foxp3同型對(duì)照確定其陽(yáng)性信號(hào)，最后測(cè)定CD4CD25Foxp3管，檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分含量。

1.5 IL-10檢測(cè) 采用Elisa法，按試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+Foxp3+Treg檢測(cè)結(jié)果 利用流式細(xì)胞儀上的Cellquest軟件對(duì)各組進(jìn)行分析。見圖1、2。麻風(fēng)康復(fù)者組的CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

圖1 麻風(fēng)康復(fù)組CD4+CD25+Foxp3+Treg含量圖2 正常組CD4+CD25+Foxp3+Treg含量

2.2 兩組IL-10水平 麻風(fēng)康復(fù)者組的外周血中IL-10明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平相關(guān)性分析 麻風(fēng)康復(fù)的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相關(guān)性(r=0.561，P<0.05)；正常對(duì)照組中的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相關(guān)性(r=0.422，P<0.05)。

表1 各組CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10含量

3 討論

麻風(fēng)是由麻風(fēng)分枝桿菌感染所致的一種傳染病，與機(jī)體免疫功能有關(guān)。在接觸相同數(shù)量的麻風(fēng)桿菌，只有少數(shù)人發(fā)病。說明患者中存在不同程度的細(xì)胞免疫缺陷，而這些細(xì)胞免疫機(jī)制尚不明確。研究表明不同Th細(xì)胞亞群及其分泌的細(xì)胞因子功能紊亂在麻風(fēng)發(fā)病發(fā)展中起著重要作用，免疫狀態(tài)失衡可導(dǎo)致麻風(fēng)患者促發(fā)和加劇病情變化。

CD4+CD25+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞，進(jìn)入組織中會(huì)抑制自身免疫細(xì)胞，使機(jī)體形成一種免疫耐受，在一定程度上減少了自身免疫性疾病的發(fā)生，但也相應(yīng)地減弱了機(jī)體對(duì)抗感染性病原菌。CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞升高,意味著麻風(fēng)康復(fù)者的抗感染能力減弱。

IL-10是一種抑制性炎癥因子，主要是由Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等分泌，其主要功能是抑制Th1細(xì)胞，是抗炎癥的重要細(xì)胞因子。在天然免疫中，IL-10通過抑制各種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)的分化、炎癥因子釋放來達(dá)到免疫抑制；而在獲得性免疫中，IL-10通過抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子生成[5]。所以當(dāng)IL-10水平升高，表明機(jī)體的抑制Th1細(xì)胞的功能增強(qiáng)，機(jī)體容易受到外來細(xì)菌、病毒、真菌等感染，從IL-10的來源說，IL-10可以有多種細(xì)胞分泌，但主要由Th輔助T細(xì)胞分泌。

Foxp3+是CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的抑制因子的啟動(dòng)子，可通過抑制因子的表達(dá)來發(fā)揮抑制作用，或通過抑制轉(zhuǎn)錄因子活性，從而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表面存在能夠表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原，對(duì)效應(yīng)性細(xì)胞起抑制作用；或通過細(xì)胞直接接觸機(jī)制或分泌IL-10等抑制細(xì)胞因子來抑制機(jī)體的免疫細(xì)胞的分化，對(duì)機(jī)體的免疫耐受和免疫應(yīng)答具有重要作用[6]。過去的研究指出，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在麻風(fēng)患者中明顯高于健康對(duì)照組，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞可能在麻風(fēng)疾病的進(jìn)程中參與重要的作用[7]。外周血IL-10水平雖不能完全作為Treg細(xì)胞的定量分析，但可作為Treg細(xì)胞定量分析重要輔助指標(biāo)。Treg 細(xì)胞可分泌IL-10,而IL-10可促進(jìn)Treg細(xì)胞分化。本研究結(jié)果中麻風(fēng)康復(fù)組的CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+CD25+Treg數(shù)值均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，同樣外周血的IL-10水平也顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，能夠側(cè)面提示麻風(fēng)康復(fù)者的免疫功能是有所下降的。Foxp3陽(yáng)性的CD4+CD25+Treg細(xì)胞是機(jī)體具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，臨床檢測(cè)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-10水平對(duì)機(jī)體免疫功能的測(cè)定有一定意義。