暴芳芳 孫勇虎 孫樂樂 周桂芝 劉永霞 劉 紅 張福仁

1 臨床資料

患者，女，47歲。雙側(cè)眼周散在丘疹2個月，無自覺癥狀?；颊甙l(fā)病前半月曾在當?shù)孛廊菰阂虺欁⑸淙舛緱U菌毒素。發(fā)病初期眼周出現(xiàn)豆粒大丘疹，后逐漸增大。體格檢查：系統(tǒng)查體未見明顯異常。皮膚科查體：右側(cè)眼周兩個孤立黃豆大皮色丘疹，觸之較韌(圖1a)。左側(cè)眼周3個孤立丘疹，其中1個呈暗紅色，觸之較軟(圖1b)。所有皮疹均無壓痛。實驗室檢查：血常規(guī)、肝腎功能未見明顯異常。皮損病理檢查示：表皮大致正常，真皮中深層中性粒細胞、組織細胞、淋巴細胞、巨細胞浸潤。PAS染色未見菌絲孢子?？顾崛旧顾峋幮浴＝M織病理呈感染性肉芽腫改變(圖2)。組織塊血瓊脂平板(BA)培養(yǎng)7天可見菌落生長，抗酸染色示陽性桿菌(圖3)。行病理檢查同時對組織塊進行分子鑒定，與生長菌落測序結(jié)果一致，符合龜分枝桿菌序列(圖4、5)。診斷：龜分枝桿菌感染。藥物敏感性試驗結(jié)果示該菌對克拉霉素、阿米卡星敏感。治療：給予阿米卡星0.2 g，肌注，每日2次，克拉霉素500 mg，口服，每日1次，1個月后改為克拉霉素500 mg，口服，每日兩次，共治療3個月后皮損痊愈(圖1c,d)。

圖1 a、b：患者治療前左右兩側(cè)眼周呈皮色及暗紅色的豆大丘疹、結(jié)節(jié)；c、d：治療后皮損痊愈，留有部分色素沉著

2 培養(yǎng)及分子鑒定

將新鮮組織塊剪碎分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)28℃和血瓊脂平板(BA)35℃進行真菌及細菌培養(yǎng)。 SDA和BA培養(yǎng)7天均可見光滑、濕潤奶油色菌落生長，取菌落涂片行抗酸染色示陽性桿菌，初步判斷為分枝桿菌，將菌落轉(zhuǎn)種于改良羅-瓊培養(yǎng)基(中性)，3天后可見明顯菌落生長，呈淡黃色、粗糙、菜花樣。將菌落提取DNA，應用細菌(16sRNA全長)、分枝桿菌(16sRNA、Hsp65、rpoB、16S-23SrDNA區(qū)域)通用引物進行PCR及測序，將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫NCBI 中進行比對，結(jié)果與龜分枝桿菌符合。

3 藥敏試驗

應用K-B紙片瓊脂擴散法對分離菌株進行體外藥物敏感性試驗。藥物種類包括多西環(huán)素、克拉霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中介，亞胺培南、復方新諾明、左氧氟沙星和利福平。培養(yǎng)基為哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，配置菌懸液濃度為0.5麥氏單位濁度，均勻涂布于血平板，將藥物紙片置于平板中心，置于35℃溫箱，72小時觀察結(jié)果。根據(jù)不同抗生素抑菌直徑的大小確定敏感、中介和耐藥，結(jié)果示該菌對克拉霉素、阿米卡星敏感，環(huán)丙沙星中介，亞胺培南、復方新諾明、多西環(huán)素、左氧氟沙星和利福平耐藥。

圖2 表皮大致正常，真皮中深層中性粒細胞、組織細胞、淋巴細胞、巨細胞浸潤(HE,a:×100;b:×400)圖3 a:血瓊脂平板(BA)細菌培養(yǎng)7天可見光滑、濕潤奶油色菌落生長；b：抗酸染色示陽性桿菌(×1000)

圖4 菌落提取DNA進行Sanger測序峰圖

4 討論

非典型分枝桿菌(Non tuberculous Mycobacterium,NTM)是除結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌之外的其他分枝桿菌，包括偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌等[1]。龜分枝桿菌由Freidmann于1903年從龜甲中分離出，此菌是一種環(huán)境腐生菌，可廣泛存在于土壤、灰塵、供水系統(tǒng)等，人類感染大多系醫(yī)療器械消毒不嚴。上世紀七十年代起國外出現(xiàn)龜分枝桿菌感染病例報道，多為經(jīng)手術(shù)或注射等創(chuàng)傷感染，包括肺部、皮膚、皮下組織等[2，3]。國內(nèi)最早關(guān)于龜分枝桿菌感染的病例為1985年梅建等報道的肺部感染一例[4，5]，此后陸續(xù)有臨床感染病例報道，如張忠奎等[6]報道外傷導致的下肢皮膚結(jié)節(jié)、潰瘍最終鑒定為龜分枝桿菌感染，柳青等[7]報道一例患者血液中分離出龜分枝桿菌。近年來由于美容行業(yè)的發(fā)展，注射美容、填充吸脂術(shù)等廣泛應用，隨之而來的感染病例也逐年增多，多見于整形外科報道。國外見紋身、皮下注射填充物后龜分枝桿菌感染的報道[8，9]。國內(nèi)學者陳帥[10]、岳江濤[11]等曾報道面部溶脂針注射后非典型分枝桿菌感染的病例，但均未將致病菌鑒定到種[10，11]。金彥等[12]曾報道2例分別由面部注射術(shù)后引起的感染，菌種鑒定為膿腫分枝桿菌。面部注射肉毒素致龜分枝桿菌感染國內(nèi)鮮有報道。

圖5 測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果與龜分枝桿菌符合率100%

此菌感染的臨床表現(xiàn)多樣，通常在接種1～2個月出現(xiàn)，早期表現(xiàn)為無自覺癥狀的紅斑、丘疹、皮下結(jié)節(jié)，隨著時間遷移會出現(xiàn)波動及潰瘍或形成竇道，有時皮損形態(tài)、分布與孢子絲菌病類似從而易導致誤診，免疫抑制患者甚至可出現(xiàn)全身播散性感染。因此在對常規(guī)治療抵抗或呈現(xiàn)“冷”膿腫的患者應仔細追問病史如有無外傷史、注射史等并考慮此類菌的感染。治療可根據(jù)培養(yǎng)菌株的藥敏實驗結(jié)果進行相應系統(tǒng)用藥并可配合局部手術(shù)切除，目前幾乎所有龜分枝桿菌對克拉霉素敏感，治療時間需3～6個月或更長時間[13]。

由于此類感染在臨床相對少見，因此臨床醫(yī)生對此類感染警覺性不高，加上對實驗室檢查重視不夠易導致誤診。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，應用病原微生物基因組某區(qū)域的特異性DNA片段，通過PCR及測序技術(shù)能快速、準確將病原菌鑒定至種水平，可作為臨床輔助檢查的重要手段。由于皮膚感染的臨床表現(xiàn)多樣，憑肉眼觀察往往無法判定感染病原菌類型，因此對感染性皮損進行真菌(ITS區(qū)域)、細菌(16sRNA全長)、分枝桿菌(16sRNA、Hsp65、rpoB、16S-23SrDNA區(qū)域)等多種微生物檢測有利于快速、準確、全面尋找病因，避免誤診漏診。