劉小琴，楊巖，吳喆瑜，鞏建業(yè)，劉嘉男，廖輝，李文靜，李利君,2, 3*

1(集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門，361021)2(福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門，361021) 3(廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門，361021)

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase, EC3.2.1.40)是一種糖基水解酶[1]，廣泛來(lái)源于動(dòng)物組織[2]、植物組織[3]以及酵母、真菌和細(xì)菌[3-4]中。不同來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶在酶學(xué)性質(zhì)上存在一定差異，但大部分α-L-鼠李糖苷酶的最適pH 4～8[5]，最適溫度40～70 ℃[6]。α-L-鼠李糖苷酶可特異性地水解末端帶鼠李糖的黃酮類，黃烷酮(如橙皮苷、柚皮苷)，黃酮醇(如槲皮苷、蘆丁)[1]等物質(zhì)，以及人工底物對(duì)硝基苯基-α-L-鼠李糖苷(4-nitrophenyl-a-L-rhamnopyranoside,pNPR)，主要作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷鍵[6]。

α-L-鼠李糖苷酶在食品與制藥等行業(yè)中有很大的應(yīng)用價(jià)值。制藥行業(yè)中，可用于制備L-鼠李糖[7]；水解蘆丁生成生物活性更高的異槲皮苷[8]；參與人體結(jié)核病的治療[9]。食品行業(yè)中，可用于柑橘類果汁的脫苦[10]，將果汁中的苦味物質(zhì)柚皮苷降解生成普魯寧，提高果汁的口感；也可以水解柑橘類果汁中的橙皮苷，防止果汁中出現(xiàn)橙皮苷晶體而造成混濁狀[11]；在葡萄酒釀造過(guò)程中，增加芳香族化合物，從而增加葡萄酒的香氣成分[12]。酶的熱穩(wěn)定性對(duì)其在工業(yè)應(yīng)用中具有極大的意義，如酶作用的底物的溶解度隨溫度的增大而增加，提高反應(yīng)速率等，其次可以更加清楚了解蛋白質(zhì)折疊、識(shí)別和穩(wěn)定過(guò)程[13]，因此為了滿足α-L-鼠李糖苷酶在食品制藥行業(yè)中的應(yīng)用，研發(fā)具有更加優(yōu)良性質(zhì)的酶，對(duì)進(jìn)一步研究其生物活性，分析熱穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有重大意義。

此前研究表明，嗜熱蛋白中有賴氨酸轉(zhuǎn)變成精氨酸的趨勢(shì)，故在蛋白質(zhì)的合適位置引入精氨酸有利于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的提高。KUMAR等[14]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸在嗜熱酶、嗜溫酶中出現(xiàn)的頻率是6.1%、6.5%； 而賴氨酸在嗜熱酶、嗜溫酶中出現(xiàn)的頻率則為4.6%、3.6%，表明精氨酸在嗜熱酶和嗜溫酶中出現(xiàn)的頻率較高。通過(guò)比較和分析嗜熱酶、嗜溫酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表面的賴氨酸替代為精氨酸可以提高其熱穩(wěn)定性[15]。PoPMuSiC可以依據(jù)1個(gè)新統(tǒng)計(jì)勢(shì)的能量項(xiàng)變化的線性組合，從而估算突變引起的穩(wěn)定性改變，評(píng)估序列最優(yōu)性。這個(gè)新統(tǒng)計(jì)勢(shì)，基于引入與蛋白質(zhì)序列以及結(jié)構(gòu)相關(guān)的4個(gè)描述相符，進(jìn)一步定義與它們之間的聯(lián)接相關(guān)的能量項(xiàng)集，同時(shí)考慮突變所致氨基酸體積的變化[16-17]。由此，實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)由精氨酸替換賴氨酸的策略以及通過(guò)PoPMuSiC分析α-L-鼠李糖苷酶三維結(jié)構(gòu)模型，確定突變的氨基酸位點(diǎn)，構(gòu)建了K440R、K402R、K573V、E631F4個(gè)單點(diǎn)突變體，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)突變體在熱穩(wěn)性質(zhì)上有一定程度的提高，在單點(diǎn)突變體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建聯(lián)合突變體，進(jìn)一步探究α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性的變化，并通過(guò)圓二色譜分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)突變體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并對(duì)熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)變化分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 菌株

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母SMD1168由本實(shí)驗(yàn)室保藏。含pPIC9K-rha重組質(zhì)粒的DH5α菌株；含pPIC9K-rha重組質(zhì)粒的畢赤酵母SMD1168菌株，K440R, K402R, K573V, E631F突變體為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker、限制性內(nèi)切酶Sal I購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入試劑盒購(gòu)于東洋紡(上海)生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)、DNA純化回收試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口。

1.1.3 溶液及培養(yǎng)基

所用溶液：Amp溶液、磷酸鹽緩沖液、10×甘油、1 mol/Ld-山梨醇、0.02%生物素、10×YNB、10 mmol/L Tris-HCl溶液、1 mmol/L EDTA溶液、畢赤酵母破壁溶液、溶壁酶反應(yīng)緩沖液、蛋白上樣緩沖液、染色液、脫色液、酶反應(yīng)緩沖液、1 g/LpNPR。

其中，磷酸鹽緩沖液：1 mol/L K2HPO4和1mol/L KH2PO4對(duì)調(diào)至pH 6.0，高溫高壓滅菌后，放置4 ℃冷藏備用。酶反應(yīng)緩沖液：0.02 mol/L Na2HPO4和0.01 mol/L檸檬酸對(duì)調(diào)至pH 3.0～8.0，放置4 ℃冷藏備用。1 g/LpNPR：0.1 gpNPR用酶反應(yīng)緩沖液溶解并定容至100 mL，放置4 ℃冷藏備用。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、MD培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

PoPMuSiC定義了4個(gè)結(jié)構(gòu)變量：氨基酸類型(s)，主鏈構(gòu)象(t)，溶劑可及性(a)和殘基距離(d)。當(dāng)變量的組合數(shù)量為2個(gè)時(shí)，c1、c2表示任意的描述子，則其統(tǒng)計(jì)勢(shì)能如公式(1)所示：

(1)

式中：P表示描述子及其組合在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)集合中出現(xiàn)的概率，k表示常量，T表示溫度。當(dāng)n為3時(shí)，由公式(2)、(3)表示：

(2)

更多變量組合時(shí)，由此可類推：

(3)

基于以上統(tǒng)計(jì)能量值，得出了42個(gè)子勢(shì)能項(xiàng)， PoPMuSiC中所采用了其中 13 個(gè)勢(shì)能項(xiàng)組合，分別為：ΔWst、ΔWas、ΔWsd、ΔWsds、ΔWstt、ΔWsst、ΔWaas、ΔWass、ΔWast、ΔWasd、ΔWstd、ΔWasdas、ΔWstdst。

PoPMuSiC還考慮了突變前后氨基酸體積的變化，并用相應(yīng)(ΔV-) 和(ΔV+) 來(lái)表示體積的增加和減少。則折疊自由能量如公式(4)所示：

(4)

通過(guò)PoPMuSiC網(wǎng)站分析黑曲霉JMU-TS528 α-L-鼠李糖苷酶三維結(jié)構(gòu)模型，計(jì)算單點(diǎn)突變體折疊自由能的變化，從而預(yù)測(cè)影響熱穩(wěn)定性的氨基酸位點(diǎn)，以及通過(guò)精氨酸替換賴氨酸策略和結(jié)合Discovery Studio 2016分析確定突變位點(diǎn)，得到熱穩(wěn)定性提高的單點(diǎn)突變體，最后將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的單點(diǎn)突變體進(jìn)行聯(lián)合突變。

1.2.2 聯(lián)合突變質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化并篩選

將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的單點(diǎn)突變體的質(zhì)粒提取出來(lái)進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建雙點(diǎn)突變質(zhì)粒。構(gòu)建好的雙點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli感受態(tài)細(xì)胞，Amp抗性篩選重組子。篩選出的重組子進(jìn)行菌液PCR后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)有條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 電轉(zhuǎn)入酵母SMD1168及篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

將測(cè)序成功的突變質(zhì)粒用Sal Ⅰ進(jìn)行線性化回收，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂于MD平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。將MD平板上的單菌落挑取在含G418抗性的平板上，最后長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行保種和鑒定。

1.2.4 突變體酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

1%接種量接種于100 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、 200 r/min振蕩培養(yǎng)，使OD600達(dá)到3.0左右。4 000 r/min離心5 min收集菌體，并用BMMY培養(yǎng)基將菌體重懸至三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h加入500 μL甲醇。加入6次甲醇后，在10 000 r/min離心5 min，收集上清，放置于4 ℃冰箱備用。

將上步得到的酶液經(jīng)過(guò)30 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，取柱體積的1%～2%體積的酶液上樣，先用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)平衡Sephacryl S-200HR凝膠柱，上樣后用同一緩沖液進(jìn)行流洗，流洗的流速為0.8 mL/min，收集速度為3 min/管。按峰收集流洗液并測(cè)定各管的酶活和蛋白含量，將有酶活的管合并。

1.2.5 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

參照碧云天生物公司配制蛋白膠的方法配蛋白膠的分離膠和濃縮膠。

取酶液30 μL與10 μL蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，冰上冷卻10 min，12 000 r/min離心2 min， 進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后，將蛋白膠從膠板上取下來(lái)后，加入考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色。

1.2.6 突變體酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

初始酶活測(cè)定方法：以pNPR為底物，測(cè)定WT和突變體酶的蛋白濃度并稀釋至相同，在60 ℃放置10 min后，加入200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，空白對(duì)照為在100 ℃條件下處理20 min滅活的WT和突變體酶。反應(yīng)終止后，吸取200 μL至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在410 nm下測(cè)定吸光值。

最適溫度測(cè)定方法：以pNPR為底物，將WT和突變體酶放置于30～70 ℃，其他反應(yīng)條件相同測(cè)定酶活，空白對(duì)照為在100 ℃條件下處理20 min滅活的WT和突變體酶。反應(yīng)終止后，測(cè)定吸光值。

最適pH測(cè)定方法：以pNPR為底物，將WT和突變體酶放置在pH 3～8緩沖液中，其他反應(yīng)條件相同測(cè)定酶活，空白對(duì)照為在100 ℃條件下處理20 min滅活的WT和突變體酶。反應(yīng)終止后，測(cè)定吸光值。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定方法：以pNPR為底物，將WT和突變體酶置于60、65、70 ℃下處理一定時(shí)間，其他反應(yīng)條件相同測(cè)定酶活，空白對(duì)照為在100 ℃條件下處理20 min滅活的WT和突變體酶。反應(yīng)終止后，測(cè)定吸光值。

1.2.7 突變體微觀結(jié)構(gòu)分析

利用PyMol軟件在原始型酶三維結(jié)構(gòu)模型的基礎(chǔ)上，構(gòu)建突變體三維結(jié)構(gòu)模型，并通過(guò)Discovery Studio 2016和在線網(wǎng)站PIC(http://pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)部相互作用的變化。

1.2.8 突變體結(jié)構(gòu)分析

利用圓二色譜(circular dischorism, CD)、熒光光譜以及分析動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)熱穩(wěn)性提高的聯(lián)合突變體進(jìn)行分析。圓二色譜分析如下：純化的原始型酶和突變體酶在水中透析并稀釋至同一質(zhì)量濃度，蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，掃描范圍為185～255 nm，比色皿光徑為0.5 mm，檢測(cè)步長(zhǎng)為1 nm，每個(gè)樣品掃描3次，最后用CDNN分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。

分子動(dòng)力學(xué)模擬采用軟件Gromacs 5.1.4進(jìn)行，模擬條件在恒定壓強(qiáng)(常壓)，300K下進(jìn)行，力場(chǎng)采用Gromos 96.1(53A6)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸和賴氨酸在嗜熱酶、嗜溫酶中出現(xiàn)的頻率不同，且精氨酸在嗜熱酶、嗜溫酶出現(xiàn)的頻率均比賴氨酸高[14]。SOKALINGAM等[18]選擇10個(gè)蛋白質(zhì)，引入精氨酸之后進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)精氨酸引入后鹽橋和氫鍵的數(shù)量增加，表明賴氨酸替代為精氨酸后有利于提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過(guò)精氨酸替換賴氨酸策略并結(jié)合Discovery Studio 2016預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)，進(jìn)行單點(diǎn)突變后得到3個(gè)熱穩(wěn)定性提高的突變體：K406R, K440R, K573R。PoPMuSiC使用已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集來(lái)計(jì)算某些殘基或原子在不同的結(jié)構(gòu)環(huán)境中的條件概率，為一個(gè)蛋白質(zhì)的每一對(duì)殘基指派一個(gè)能量，如果2個(gè)殘基間的距離在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的頻率高，那么相互作用就有一個(gè)低的能量；反之亦然。依賴于此統(tǒng)計(jì)勢(shì)能判斷出突變前后對(duì)蛋白的影響，由此應(yīng)用PoPMuSiC對(duì)黑曲霉JMU-TS528 α-L-鼠李糖苷酶三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析，計(jì)算出突變前后勢(shì)能的變化，預(yù)測(cè)突變的氨基酸位點(diǎn)，進(jìn)行單點(diǎn)突變后得到突變體：E631F，將這不同的氨基酸位點(diǎn)突變的單點(diǎn)突變體進(jìn)行聯(lián)合突變，得到4個(gè)聯(lián)合突變體：K406R-K573V, K406R-K440R, K440R-E631F, K573V-E631F。

2.2 聯(lián)合突變體的真核表達(dá)

將原始型α-L-鼠李糖苷酶(WT)和4個(gè)聯(lián)合突變體(K406R-K573V, K406R-E631F, K440R-K573V, K440R-E631F)進(jìn)行發(fā)酵，離心和超濾濃縮收集酶液，收集后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，如圖1所示，均為100 kDa左右，片段大小正確，可進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)。

M-蛋白質(zhì)Marker；1-WT；2-K406R-K573V；3-K406R-E631F；4-K440R-K573V；5-K440R-E631F圖1 原始型α-L-鼠李糖苷酶和各個(gè)突變體的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of WT and mutants of α-L-rhamnosidase

2.3 突變體酶學(xué)性質(zhì)

測(cè)定WT和聯(lián)合突變體K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F的蛋白濃度，并將蛋白濃度統(tǒng)一至同一水平，在相同條件下測(cè)定它們的初始酶活。如圖2所示，與WT相比，K440R-K573V的初始酶活降低幅度較大，影響其酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，文章后面不再對(duì)此突變體贅述；其他聯(lián)合突變體的酶活與WT相差不大。

圖2 原始型α-L-鼠李糖苷酶和突變體的初始酶活Fig.2 Initial enzyme activity of WT and mutants of α-L-rhamnosidase

測(cè)定WT和聯(lián)合突變體的最適溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性。各個(gè)突變體的最適溫度與WT的一致(圖3)，均為60 ℃，表明在單點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行聯(lián)合突變構(gòu)建的聯(lián)合突變體，并沒有影響酶的最適溫度。各個(gè)突變體在70 ℃的相對(duì)酶活均比WT的要高，最高可達(dá)83%。

圖3 原始型和突變體的最適溫度Fig.3 Optimum temperature of WT and mutants

由此可看出，聯(lián)合突變體的成功構(gòu)建提高了酶的熱穩(wěn)定性，且蛋白質(zhì)分子改造能改善酶的熱穩(wěn)定性。

聯(lián)合突變體的最適pH與WT的一致，均為pH 4(圖4)，在pH 4～5的情況下，突變體的相對(duì)酶活相差不大。K440R-E631F在pH 3～8的相對(duì)酶活均比WT高，推測(cè)突變可能增強(qiáng)酶的酸堿耐受性。

圖4 原始型和突變體的最適pHFig.4 Optimum pH of WT and mutants

測(cè)定聯(lián)合突變體K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-E631F與WT在60、65和70 ℃條件下處理一段時(shí)間后的熱失活曲線，并通過(guò)熱失活曲線擬合半衰期，比較它們熱穩(wěn)定性之間的差異(圖5、表1)。

A-60 ℃穩(wěn)定性；B-65 ℃穩(wěn)定性；C-70 ℃穩(wěn)定性圖5 原始型和突變體的溫度穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of WT and mutants

表1 突變體的基本酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic property of WT and mutants

除了K406R-E631F外，其他聯(lián)合突變體K406R-K573V、K440R-E631F在60 ℃的熱穩(wěn)定性均比WT好，半衰期比WT分別提高了1、3.5 h(表1)。聯(lián)合突變體K406R-K573V、K440R-E631F在65 ℃的半衰期與WT相比(圖5-B)，分別提高了30、25 min(表1)。突變體K406R-E631F在65 ℃的穩(wěn)定性比WT相比略有下降，降低了6 min。所有的聯(lián)合突變體在70 ℃熱穩(wěn)定性均比WT好(圖5-C)，K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-E631F半衰期與WT相比分別提高了3.5、1.8、2.7 min。

綜上分析，突變體K440R-K573V酶活與WT相比損失很多，突變體K406R-E631F與WT相比，熱穩(wěn)定性并沒有顯著提高，反而在60和65 ℃有所降低。K406R-K573V、K440R-E631F的熱穩(wěn)定性提高。

2.4 突變體結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 圓二色譜分析

圓二色譜(CD)是用于測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)用最廣泛的方法。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)一般有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、 無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋是最典型的結(jié)構(gòu)。從圖6中可見，突變體K440R-E631F在208 nm有強(qiáng)的負(fù)吸收峰，在192 nm有強(qiáng)的正吸收峰，結(jié)合CDNN軟件計(jì)算后，從表2可看出，其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多，β-折疊結(jié)構(gòu)降低。

圖6 原始型α-L-鼠李糖苷酶和突變體K440R-E631F的圓二色譜圖Fig.6 Circular dichroism spectrum of WT and K440R-E631F

表2 原始型α-L-鼠李糖苷酶和突變體K440R-E631F的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例Table 2 The secondary structure ratio of WT and K440R-E631F

研究表明，大量的α-螺旋有利于提高蛋白質(zhì)的剛性，故適當(dāng)提高蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[14]；無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)就空間結(jié)構(gòu)中沒有規(guī)律性的區(qū)域，其結(jié)構(gòu)柔性強(qiáng)，構(gòu)象變化大，故無(wú)規(guī)則卷曲的減少也可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，與WT相比，突變體K440R-E631F α-螺旋含量增多，無(wú)規(guī)則卷曲增多，可能與熱穩(wěn)定性提高有關(guān)。

2.4.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

將WT和K440R-E631F進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，并得到RMSD和RMSF結(jié)果圖。根據(jù)RMSD結(jié)果可以看出(圖7)，WT和突變體在5 000 ps已經(jīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。K440R-E631F的波動(dòng)幅度比WT稍大。根據(jù)RMSF結(jié)果(圖8-A)，K440R-E631F突變體中氨基酸柔性比WT更加均勻，而蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是剛?cè)嵯嗷プ饔玫倪^(guò)程，可能K440R-E631F突變體中氨基酸柔性和剛性的比例更加合適才使得其穩(wěn)定性提高。分析406位和573位周圍氨基酸的RMSF值發(fā)現(xiàn)(圖8-B)，突變體K440R-E631F中390～413位氨基酸(α-螺旋區(qū))RMSF值變化不大，414～423位氨基酸(位于(α/α)6桶裝結(jié)構(gòu)loop區(qū))柔性增強(qiáng)，562～590位氨基酸(loop區(qū))柔性增強(qiáng)，loop區(qū)柔性的增強(qiáng)有利于蛋白質(zhì)與底物之間的結(jié)合。

圖7 WT和K440R-E631F的RMSD圖Fig.7 RMSD of WT and K440R-E631F

圖8 WT和K440R-E631F的RMSF圖Fig.8 RMSF of WT and K440R-E631F

2.5 突變體微觀結(jié)構(gòu)變化

VOGT等[19-20]對(duì)16個(gè)蛋白家族中的蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)絕大部分蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越高，其氫鍵的數(shù)量也越多，表明氫鍵數(shù)量的增加可以使蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性提高。此外，疏水相互作用取決于蛋白質(zhì)中疏水氨基酸的個(gè)數(shù)和位置，當(dāng)疏水氨基酸處于蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí)，有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，維持蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究通過(guò)WT三維結(jié)構(gòu)模型和PyMol軟件構(gòu)建所有突變體的三維結(jié)構(gòu)模型，并用Discovery Studio 2016和PIC預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)部鍵能的變化。對(duì)K406R-K573V進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，K406R-K573V比WT內(nèi)部氫鍵數(shù)增加，同時(shí)疏水相互作用和陽(yáng)離子-π作用減少。K440R-E631F突變體與WT相比，其熱穩(wěn)定性有所提高，并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)部疏水性在一定程度也有所提高，推測(cè)疏水性的改變可能影響了它的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用精氨酸替換賴氨酸策略以及PoPMuSiC預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)，改造α-L-鼠李糖苷酶，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的K406R, K440R, K573V, E631F四個(gè)不同氨基酸位點(diǎn)的單點(diǎn)突變體進(jìn)行聯(lián)合突變，得到了2個(gè)熱穩(wěn)定性提高的聯(lián)合突變體。與WT相比，突變體K406R-E631F熱穩(wěn)定性并沒有顯著提高，突變體K440R-E631F的熱穩(wěn)定性顯著提高。其中，K440R-E631F內(nèi)部疏水性有所增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、 無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多，可能與熱穩(wěn)定性提高有關(guān)；分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)整體波動(dòng)幅度與原始型相比較小。α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性的提高，使α-L-鼠李糖苷酶在食品、制藥行業(yè)中可以得到更好的應(yīng)用，同時(shí)，也為研究具有更優(yōu)熱穩(wěn)定性的酶提供理論依據(jù)。