姚沛琳，王劍，張新劍，黃悅

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州，234000)

細(xì)菌生物膜是附著于物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體，與浮游狀態(tài)的細(xì)菌相比，對(duì)抗生素和宿主免疫防御系統(tǒng)具有較強(qiáng)的抗逆性[1-2]。細(xì)菌生物膜具有群體感應(yīng)，以“團(tuán)隊(duì)作戰(zhàn)能力”使整個(gè)種群更好地存活下來(lái)[3-4]?，F(xiàn)已證明，很多久治不愈的慢性細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān)[5]，如肺囊性纖維化，彌漫性泛細(xì)支氣管炎，牙周炎，腸道感染，心瓣膜性心內(nèi)膜炎等[6]。

大腸桿菌是引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化道系統(tǒng)感染的常見(jiàn)病原菌，也是研究容易形成生物膜的模式病原菌[7]。抗生素法是目前臨床上治療致病菌生物膜感染最常用的方法，宋雅山等[8]的研究表明，米諾環(huán)素對(duì)大腸桿菌生物膜有抑制作用，可以緩解透析相關(guān)腹膜炎。陳盛等[9]的研究表明，巰乙磺酸鈉可顯著減少大腸桿菌的黏附及產(chǎn)EPS的能力。中草藥法抑菌取得了一定的研究進(jìn)展[10]，李斌等[11]研究表明，黑木耳提取物對(duì)大腸桿菌生物膜形成有抑制作用。喻華英等[12]研究表明，黃連、苦豆子、金銀花和連翹可以抑制大腸桿菌生物膜的形成?？股赜捎谝鸺?xì)菌抗藥性的問(wèn)題，世界范圍內(nèi)正在呼吁減少抗生素的使用[13]。中草藥法雖然比較溫和，但是由于其本身味道的限制，在實(shí)際應(yīng)用上有很大的局限性[14]。因此以益生菌為主的細(xì)菌替代療法越來(lái)越受到關(guān)注，其中乳酸菌是目前最常見(jiàn)的一類(lèi)益生菌。

乳酸菌具有多種益生功能[15-16]。在乳酸菌抑制變異鏈球菌(引起齲齒的主要病原菌)生物膜的研究中取得了一定的研究進(jìn)展。KHAN等[17]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于印度藏茴香種子的提取物能夠降低變異鏈球菌生物膜的活性，抑制變異鏈球菌對(duì)唾液包被羥基磷灰石的黏附和水不溶性葡聚糖的合成。KANG等[18]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于兒童唾液的2株食寇魏斯氏菌CMS1和CMS3能夠顯著抑制變異鏈球菌生物膜的形成，并且它們合成的水溶性葡聚糖也能夠抑制變異鏈球菌生物膜的形成。乳酸菌對(duì)致病菌的抑制作用機(jī)理，除了產(chǎn)生抑菌物質(zhì)對(duì)致病菌有殺傷作用外，與致病菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者黏附位點(diǎn)的爭(zhēng)奪也密切相關(guān)[19]。而目前在該領(lǐng)域的研究，多是研究乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)游離大腸桿菌的抑制作用，很少涉及到乳酸菌的代謝產(chǎn)物或乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜的抑制作用。

乳酸菌具有中草藥無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如味道上可以被絕大多數(shù)人群接受，乳酸菌的攝入可以增加體內(nèi)有益菌的數(shù)量，再加上益生菌概念深入人心，為乳酸菌的應(yīng)用提供了可行性。乳酸菌對(duì)大腸桿菌生物膜的研究還未見(jiàn)報(bào)道，所以此領(lǐng)域具有較大的研究?jī)r(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)體外生物膜的方法研究乳酸菌對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

乳酸菌來(lái)源：從皖南、皖北地區(qū)采集的家庭自制腌制菜、市售酸奶、自制葡萄酒等。

大腸桿菌ATCC25922，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 設(shè)備及試劑

1-15PK離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；SHP-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS IX71熒光倒置顯微鏡，廣州市明美科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR試劑盒、溶菌酶、PI染料、CFSE染料等，均購(gòu)于上海生物工程有限公司；甲醇、結(jié)晶紫、乙醇、NaH2PO4、Na2HPO4、牛膽鹽、NaCl等化學(xué)試劑，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

從皖南、皖北地區(qū)采集的家庭自制腌制菜的汁液中分離乳酸菌菌株。無(wú)菌操作取1 mL的樣品，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，直至稀釋到10-5。取10-3、10-4、10-5這3個(gè)梯度的稀釋液各0.1 mL分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。采用平板劃線法，挑取典型菌落，多次劃線后得到純菌株。經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢、接觸酶實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶實(shí)驗(yàn)陰性的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，-80 ℃甘油保藏[20]。

1.3.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[21]。將活化3代的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，在4 ℃和12 000 r/min下離心30 min，用0.22 μm微孔濾膜將離心后的菌液進(jìn)行過(guò)濾，得到乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液。將活化3代的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)OD至0.3，大腸桿菌的菌落數(shù)控制在1×108CFU/mL左右。LB固體培養(yǎng)基與大腸桿菌菌液混合凝固后，用鑷子將無(wú)菌的牛津杯(內(nèi)徑為6 mm)輕輕地、均勻地放置在培養(yǎng)皿上。往每一個(gè)牛津杯里加入200 μL乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，將此平板正面靜置于37 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈大小。

1.3.3 乳酸菌對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響

1.3.3.1 微孔板法

(1)乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響

參考O’TOOLE等[22]的方法進(jìn)行。大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌濃度為OD=0.1，每孔加入此濃度的大腸桿菌菌懸液150 μL，再加入150 μL乳酸菌發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)的液體，用PBS緩沖液洗滌3次，用甲醇[11]固定15 min，倒掉液體吹干。用結(jié)晶紫染色15 min，清除染液后，用去離子水洗滌3次，吹干。加200 μL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，置于搖床緩慢搖擺30 min，酶標(biāo)儀600 nm。測(cè)定吸光度。各實(shí)驗(yàn)組每次做5個(gè)平行，重復(fù)3次。分別用水和甲醇作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

(2)乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響

在實(shí)驗(yàn)(1)的基礎(chǔ)上做了如下改動(dòng)，每孔加入150 μL濃度為OD=0.01的大腸桿菌菌懸液和150 μL濃度為OD=0.01的乳酸菌菌懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h。其他條件同實(shí)驗(yàn)(1)。

1.3.3.2 熒光顯微鏡法

(1)乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響

大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌濃度為OD=0.1±0.05。 將活化3代的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，離心取發(fā)酵上清液。在直徑6 cm的玻璃培養(yǎng)皿中放入18 mm×18 mm規(guī)格的無(wú)菌蓋玻片，加入1 mL大腸桿菌菌懸液和3 mL乳酸菌發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出玻璃片，PBS沖洗3次，去除表面浮游細(xì)菌，立即于室溫避光條件下用熒光染料CFSE和PI分別對(duì)活菌和死菌進(jìn)行染色。30 min后，取出蓋玻片，沖洗染液，在熒光顯微鏡下觀察成膜情況[23]。

(2)乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響

在實(shí)驗(yàn)(1)的基礎(chǔ)上做如下改動(dòng)，培養(yǎng)皿中加入1 mL菌濃度為OD=0.01大腸桿菌菌懸液和3 mL菌濃度為OD=0.01乳酸菌菌懸液。37 ℃培養(yǎng)24 h。其他條件同實(shí)驗(yàn)(1)。

1.3.4 菌株的耐酸性測(cè)定

將純化活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)1%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h后，按1% 接種量分別接入pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧，測(cè)定600 nm下的吸光值(OD600)，并記錄結(jié)果[24]。

1.3.5 菌株的耐膽鹽性測(cè)定

菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，再按2%的接種量分別接種于含0、0.1%、 0.2%、0.3%、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%巰基乙酸鈉)，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS-THIO培養(yǎng)基為對(duì)照，分別測(cè)定上述不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基在600 nm下的吸光度，按照公式(1)計(jì)算乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受力[25]。

(1)

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用SPSS Statistics 17.0單因素方差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析(One-Way，ANOVA)。顯著性水平設(shè)置為0.05，其中P<0.05代表差異顯著。采用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌對(duì)大腸桿菌的抑菌性分析

從不同來(lái)源的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出了90株乳酸菌，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定這90株乳酸菌的發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，大多數(shù)乳酸菌對(duì)大腸桿菌都有不同程度的抑制作用。牛津杯法測(cè)定的抑菌效果是在大腸桿菌非生物膜狀態(tài)下進(jìn)行的研究，而相關(guān)的研究成果表明[23]，乳酸菌的抑菌性與抑制生物膜能力不是呈正相關(guān)。因此，為了篩選出對(duì)大腸桿菌生物膜具有較強(qiáng)抑制能力的乳酸菌，根據(jù)前期研究中的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別從好、中、差3個(gè)水平中隨機(jī)選取10株乳酸菌(即2-1、3-1、15-2、7-1、A-1、7-2、10-1、1-1、11-3、13-1)研究其發(fā)酵上清液和菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成的抑制情況，這10株乳酸菌的牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 10株乳酸菌的抑制大腸桿菌的效果Fig.1 The inhibited effect of 10 species of LAB on E.coli

2.2 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜形成量的影響

乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)生物膜形成量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(陰性組為無(wú)菌水，陽(yáng)性組為甲醇)均有顯著性差異(P<0.05)，其中7-1和11-3表現(xiàn)出了非常好的抑制效果，對(duì)生物膜的抑制率分別達(dá)到84.59%和85.19%，抑制效果其次的是2-1、3-1、7-2、10-1、13-1。同時(shí)由圖1和圖2的比較可知，乳酸菌的抑菌性與其對(duì)大腸桿菌生物膜形成的抑制效果之間并不存在規(guī)律性。

圖2 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜形成量的影響Fig.2 The effect of the culture supernatant of LAB on E.coli biofilm formed quantity

2.3 乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成量的影響

乳酸菌菌體對(duì)生物膜形成量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在3-1、7-1和15-2的作用下，不僅不會(huì)抑制大腸桿菌生物膜的形成，反而會(huì)促進(jìn)其生物膜的形成。2-1、7-2、11-3與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P<0.05)， 因此無(wú)抑制效果。1-1與甲醇的作用效果相當(dāng)。A-1、10-1、13-1表現(xiàn)出較好的抑制效果，抑制率分別達(dá)到65.20%、70.09%和64.59%。

圖3 乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成量的影響Fig.3 The effect of LAB on E.coli biofilm formed quantity

綜合圖2和圖3的結(jié)果可知，乳酸菌發(fā)酵上清液和乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成的抑制效果差別較大，兩者無(wú)相關(guān)性。乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜的形成均表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是乳酸菌菌體的作用效果較為復(fù)雜，有的表現(xiàn)出較好的抑制效果，而有的卻表現(xiàn)出促進(jìn)效果。綜合來(lái)看，10-1、 13-1這2株乳酸菌的發(fā)酵上清液和菌體均表現(xiàn)出較好的抑制大腸桿菌生物膜形成的效果。

2.4 熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)

通過(guò)聚苯乙烯材質(zhì)的96平底孔板作為體外生物膜模型對(duì)生物膜進(jìn)行定量是一種傳統(tǒng)方法[26]。因此，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸菌發(fā)酵上清液實(shí)驗(yàn)中抑制效果較好的2株乳酸菌，即7-1和11-3，以及乳酸菌菌體實(shí)驗(yàn)中抑制效果較好的3株乳酸菌，即10-1、13-1和A-1，采用熒光顯微鏡法，觀察所形成的生物膜的構(gòu)造，結(jié)果分別如圖4和圖5所示。

由圖4可知，在相同的熒光強(qiáng)度下，未用任何試劑處理的常態(tài)生物膜(圖4-A和圖4-B)，活菌占主導(dǎo)地位，菌體成團(tuán)塊蘑菇狀緊密地連接在一起，有孔狀通道，呈現(xiàn)出典型的生物膜結(jié)構(gòu)。而添加了7-1和11-3的發(fā)酵上清液的處理組，即圖4-C和圖4-D以及圖4-E和圖4-F，生物膜結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，菌體基本上以散點(diǎn)形式分布，細(xì)菌總量明顯下降，并且死菌占主導(dǎo)地位，這一結(jié)果與用96平板測(cè)得的生物膜量的結(jié)果相同。

A、B-未添加任何試劑；C、D-添加菌株7-1的發(fā)酵上清液；E、F-添加菌株11-3的發(fā)酵上清液圖4 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響(×200)Fig.4 Effect of the culture supernatant of LAB on E.coli biofilm structure(×200)注：圖A、C、E代表活菌，圖B、D、F代表死菌。

由圖5可知，在相同的熒光強(qiáng)度下，未用任何試劑處理的常態(tài)生物膜(圖5-A和圖5-B)，活菌占主導(dǎo)地位，菌體成團(tuán)塊蘑菇狀緊密地連接在一起，有孔狀通道，具有完整的生物膜結(jié)構(gòu)。而添加了10-1、13-1、A-1菌體的處理組，即圖5-C和圖5-D、圖5-E和圖5-F 以及圖5-G和圖5-H，生物膜結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，菌體基本上以散點(diǎn)形式分布，管道結(jié)構(gòu)和團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，細(xì)菌總量明顯下降，但是活菌和死菌總量基本相當(dāng)。與用乳酸菌發(fā)酵上清液的處理結(jié)果相比較，雖然生物膜結(jié)構(gòu)與前者一樣，均完全被破壞，但是細(xì)菌總量沒(méi)有前者減少幅度大，這一結(jié)果也與用96平板測(cè)得的生物膜量的結(jié)果相同。

A、B-未添加任何試劑；C、D-添加10-1菌體；E、F-添加13-1菌體；G、H-添加A-1菌體圖5 乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響(×200)Fig.5 Effect of LAB on E.coli biofilm structure(×200)注：圖A、C、E、G代表活菌，圖B、D、F、H代表為死菌。

2.5 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，當(dāng)pH>4.0時(shí)，各菌株均生長(zhǎng)良好。隨著pH的降低，各菌株的生長(zhǎng)均受到顯著抑制。在pH=2.0時(shí)，菌株A-1的耐強(qiáng)酸性能最好，OD600可達(dá)0.289，與其他菌株有顯著性差異(P<0.05)，最差的是菌株7-1，其他3個(gè)菌株的耐酸性能均在同一水平。在pH=3.0時(shí)，菌株A-1的耐酸性能最好，OD600可達(dá)0.518，與其他菌株有顯著性差異(P<0.05)，最差的是菌株10-1，其他3個(gè)菌株的耐酸性能均在同一水平。綜合以上結(jié)果，這5株乳酸菌，耐酸性能最好的是菌株A-1，其次是菌株11-3和13-1。

2.6 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌株的存活率顯著降低。當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.5%時(shí)，菌株A-1均表現(xiàn)出較強(qiáng)的存活率，存活率分別為60.60%和37.51%，與其他菌株有顯著性差異(P<0.05)，最差的是菌株7-1，其他3個(gè)菌株的耐酸性能均在同一水平。綜合以上結(jié)果，這5株乳酸菌，耐膽鹽性能最好的是菌株A-1，其次是菌株10-1、11-3和13-1。

表1 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acid proof test result

注：表中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

表2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the test for biliary salt

3 結(jié)論

大腸桿菌在人體腸道內(nèi)屬于正常的共生菌，但是如果以生物膜形式大量存在于泌尿系統(tǒng)、消化道、呼吸系統(tǒng)等處，就會(huì)造成感染。人體內(nèi)強(qiáng)調(diào)的是一個(gè)菌群平衡的概念，雖然大腸桿菌是正常菌群，但是如果在某處以生物膜這種抗逆性強(qiáng)的形式存在，就會(huì)對(duì)人體有傷害。因此，本文從安徽不同區(qū)域采集的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中共分離得到90株乳酸菌，研究其對(duì)大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，大多數(shù)乳酸菌對(duì)大腸桿菌有抑制作用，但是結(jié)果差異較大。而乳酸菌的抑制作用與抑制大腸桿菌生物膜形成能力之間并不存在一定的規(guī)律性。從乳酸菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液和菌體兩方面研究其對(duì)大腸桿菌生物膜形成的抑制作用，分別篩選出效果較好的不同乳酸菌。兩者均可以顯著減少生物膜的形成量，完全破壞生物膜的典型結(jié)構(gòu)，使菌體在生物膜中呈零散狀分布。但是乳酸菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的作用效果要優(yōu)于乳酸菌菌體，不僅可以顯著減少細(xì)菌總量，還可以使生物膜活性顯著降低。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株7-1的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。人體胃液的pH值為2～3， 人體小腸的膽鹽濃度一般為0.03%～0.3%，可以在細(xì)胞外產(chǎn)生高滲透壓，對(duì)菌體細(xì)胞造成影響。攝入到體內(nèi)的乳酸菌，需要經(jīng)受人體極端的酸性條件和高膽鹽環(huán)境的考驗(yàn)，才能在人體真正發(fā)揮益生作用。在體外有較好益生作用的乳酸菌，必須能夠?qū)ξ敢簶O端的酸性環(huán)境具有耐受性，才能在體內(nèi)發(fā)揮益生作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株A-1(Lactobacillusacidophilus)具有較好的耐酸耐膽鹽性能。在研究乳酸菌菌體對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響時(shí)，所用到的菌株濃度為OD600=0.01，菌株A-1對(duì)大腸桿菌生物膜就表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸、強(qiáng)膽鹽的處理后，菌株A-1的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體外抑制實(shí)驗(yàn)的濃度，故在體內(nèi)具有應(yīng)用價(jià)值。乳酸菌作為目前使用較多的益生菌，具有巨大的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景，是細(xì)菌替代療法的熱門(mén)研究對(duì)象，該結(jié)果為今后預(yù)防由大腸桿菌引起的感染提供了理論依據(jù)。