段 然

（北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 102206）

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)［1］。手術(shù)是治療腦膠質(zhì)瘤的常用方法，然而由于腦膠質(zhì)瘤惡性化程度較高、侵襲和浸潤(rùn)能力較強(qiáng)，手術(shù)很難切除所有病灶。雖然放、化療可以有效控制腫瘤的生長(zhǎng)，然而由于腦部解剖位置特殊，且有血腦屏障阻礙藥物向腦部的分布，因此其療效較差，患者生存期較短［2-3］。現(xiàn)代研究表明姜黃中的有效成分姜黃素具有良好的抗腫瘤作用，對(duì)結(jié)腸、肝臟、乳腺等多種腫瘤具有良好的抑制和殺傷作用［4］。本研究探討姜黃素對(duì)人腦膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用以及其可能的作用機(jī)制，以期為新型抑制劑的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

姜黃素購(gòu)自北京金路鴻生物技術(shù)有限公司，使用無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）溶解，并配制成100mM儲(chǔ)備液，貯存于-20°C條件下。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)Biochrom公司，XTT試劑{c；3，3'-［1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉和吩嗪二甲酯硫酸鹽}、碘化丙啶以及PPAR-γ抑制劑GW9662購(gòu)自Sigma公司。RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自浙江浙科儀器設(shè)備有限公司。PPAR-γ和基因PCR引物［5］為上游：5'-CTTGGGTCGGCCTCGAG-3'，下游：5'-CATTACGGAGAGATCCACGGA-3'；GADPH基因引物為上游：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。引物由上海生工合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。培養(yǎng)基的選擇、傳代方法和時(shí)間以及培養(yǎng)條件根據(jù)按照ATCC網(wǎng)頁(yè)中的描述進(jìn)行。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱溫度37°C，二氧化碳含量5%。使用0.25%胰酶-EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解離。

1.3 細(xì)胞活力測(cè)試

腫瘤細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前一天種植于96孔板中，每孔5 000個(gè)（2.5×104個(gè)/mL，200μL），在37°C，二氧化碳含量5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基。對(duì)照組和觀察組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），分別培養(yǎng)24h、48h和72h。培養(yǎng)結(jié)束后，向各孔中加入XTT試劑，試劑用量以及反應(yīng)時(shí)間按說(shuō)明書選擇。培養(yǎng)約2h后，在450和650nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度A450和A650。細(xì)胞活力按照以下公式計(jì)算。

細(xì)胞活力（%）=處理組A450-處理組A650/（對(duì)照組A450-對(duì)照組A650）×100%

1.4 細(xì)胞周期分析

U251腫瘤細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1天種植于24孔板中，每孔300 000個(gè)（0.5 x 106個(gè)/mL，600μL），培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液。對(duì)照組和觀察組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），培養(yǎng)24h、48h和72h。培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞使用0.25%胰酶-EDTA解離，400g條件下離心10min，收集沉淀物。細(xì)胞沉淀用70%乙醇（-20°C）固定，并加入PI染色30min。染色結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液清洗2次，并將細(xì)胞重懸于300μL磷酸鹽緩沖液中，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞含量計(jì)算由Flowjo完成。

1.5 PPAR-γ基因表達(dá)的測(cè)定

U251腫瘤細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1天種植于24孔板中，每孔300 000個(gè)（0.5 x 106個(gè)/mL， 600μL），培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液。對(duì)照組和觀察組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），培養(yǎng)8h。培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA解離，并用PBS清洗一次。隨后使用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。最后加入引物，并使用rt-qPCR對(duì)PPAR-γ基因表達(dá)進(jìn)行定量。操作按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 進(jìn)行整理，并用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。計(jì)量資料以（±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于至少3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。多個(gè)樣本的比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行，并用Tukey檢驗(yàn)比較各組間差異的顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)U251細(xì)胞活力的影響

不同濃度姜黃素對(duì)U251細(xì)胞活力的影響見(jiàn)表1至表3。結(jié)果表明姜黃素對(duì)U251細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。同時(shí)，檢測(cè)了PPAR-γ抑制劑GW9662對(duì)U251細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明GW9662本身對(duì)于U251細(xì)胞的活力沒(méi)有影響，給藥24、48和72h后U251細(xì)胞的活力與對(duì)照組相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。然而，GW9662 可以顯著減弱姜黃素對(duì)U251細(xì)胞的抑制能力，接受兩種藥物共同處理的細(xì)胞活力較單獨(dú)使用姜黃素組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 姜黃素和GW9662培養(yǎng)24h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

表1 姜黃素和GW9662培養(yǎng)24h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

分組 細(xì)胞活力 t（與對(duì)照組比較）P（與對(duì)照組比較）對(duì)照組 100.0 0± 0.00姜黃素 1μM 94.04 ± 1.94 3.05 0.373姜黃素 3μM 91.96 ± 1.67 4.12 0.119姜黃素 10μM 87.50 ± 2.60 6.41 0.007姜黃素 30μM 72.64 ± 1.53 14.03 ＜0.001 GW9662 10μM 97.03 ± 0.60 1.52 0.925姜黃素 30μM + GW9662 10μM 83.98 ± 3.26 8.21 ＜0.001

表2 姜黃素和GW9662培養(yǎng)48h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

表2 姜黃素和GW9662培養(yǎng)48h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

P（與對(duì)照組比較）對(duì)照組 100.00±0.00姜黃素 1μM 91.11±2.67 4.27 0.100姜黃素 3μM 89.67±2.83 4.96 0.042姜黃素 10μM 80.85±1.94 9.20 ＜0.001姜黃素 30μM 41.74±2.42 29.87 ＜0.001 GW9662 10μM 97.86±1.21 1.03 0.988姜黃素 30μM + GW9662 10μM 75.92±0.64 11.570 ＜0.001分組 細(xì)胞活力 t（與對(duì)照組比較）

表3 姜黃素和GW9662培養(yǎng)72h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

表3 姜黃素和GW9662培養(yǎng)72h對(duì)U251細(xì)胞活力的影響 （%，±s）

P（與對(duì)照組比較）對(duì)照組 100.0±0.00姜黃素 1μM 93.27±2.31 3.15 0.339姜黃素 3μM 84.62±2.92 7.21 0.003姜黃素 10μM 74.03±2.04 12.17 ＜0.001姜黃素 30μM 46.14±2.15 25.24 ＜0.001 GW9662 10μM 98.32±1.37 0.78 0.997姜黃素 30μM + GW9662 10μM 63.60±2.71 17.06 ＜0.001分組 細(xì)胞活力 t（與對(duì)照組比較）

2.2 姜黃素對(duì)U251細(xì)胞周期分布的影響

姜黃素引起的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布見(jiàn)表4至表6。結(jié)果表明姜黃素可以誘導(dǎo)Sub-G0期細(xì)胞的相對(duì)含量，且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。分析細(xì)胞周期的分布后，姜黃素主要引起細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，且作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。在藥物作用的24～72h內(nèi)，PPAR-γ抑制劑GW9662對(duì)U251細(xì)胞Sub-G0期的含量以及G0/G1期分布沒(méi)有明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GW9662可以顯著降低姜黃素對(duì)U251細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，明顯減少位于Sub-G0期細(xì)胞的含量（P＜0.05）。同時(shí)GW9662可以逆轉(zhuǎn)姜黃素引起的G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，明顯降低G0/G1期細(xì)胞的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)24h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

表4 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)24h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對(duì)照組 7.19 ± 1.45 34.21 ± 1.54 26.92 ± 3.75 34.33 ± 2.41姜黃素 30μM 25.03 ± 2.62△ 53.73 ± 1.06△ 9.75 ± 2.31△ 38.52 ± 2.23 GW9662 10μM 6.43 ± 1.38 34.37 ± 0.46 29.69 ± 1.28 36.52 ± 2.56姜黃素 30μM +GW9662 10μM14.04 ± 0.81△ 44.12 ± 1.76△ 13.18 ± 0.91△ 35.68 ± 1.17

表5 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)48h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

表5 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)48h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對(duì)照組 4.72 ± 1.08 33.87 ± 1.35 30.9 ± 0.7 32.54 ± 2.08姜黃素 30μM 32.76 ± 2.85△45.73 ± 2.36△6.32 ± 2.63△ 19.61 ± 1.02 GW9662 10μM 7.24 ± 1.25 30.81 ± 1.88 31.57 ± 2.39 31.38 ± 1.58姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.93 ± 0.83△42.89 ± 1.8△ 11.17 ± 0.79△35.38 ± 0.71

表6 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)72h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

表6 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)72h對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 （%，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對(duì)照組 4.94 ± 1.46 35.85 ± 1.6 31.44 ± 3.56 37.88 ± 2.74姜黃素 30μM 40.08 ± 2.99△43.65 ± 1.23△9.22 ± 1.92△ 24.62 ± 1.20 GW9662 10μM 4.76 ± 0.17 35.66 ± 1.83 30.84 ± 1.09 36.19 ± 1.99姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.78 ± 0.25△ 34.92 ± 1.31 12.96 ± 0.81△ 36.34 ± 1.19

2.3 姜黃素對(duì)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響

姜黃素對(duì)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響見(jiàn)表7。姜黃素可以提高PPAR-γ基因的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。低劑量組（10μM）可以提高PPAR-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GW9662對(duì)PPAR-γ基因的轉(zhuǎn)錄不產(chǎn)生明顯影響，但可以顯著降低姜黃素引起的PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表7 姜黃素對(duì)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響 （倍，±s）

表7 姜黃素對(duì)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響 （倍，±s）

P（與對(duì)照組比較）對(duì)照組 1.00±0.00姜黃素 10μM 1.21±0.06 3.500 0.149姜黃素 30μM 1.40±0.08 6.667 0.002 GW9662 10μM 0.99±0.08 0.167 1.000姜黃素 30μM+GW9662 10μM 1.14±0.04 2.333 0.491分組t（與對(duì)照組比較）mRNA轉(zhuǎn)錄PPAR-γ/GADPH（倍數(shù)）

3 討 論

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）是一類配體激活型核受體，其活性與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡以及腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的變化有密切聯(lián)系。體外研究表明，PPAR-γ受體在包括乳腺癌、肺癌、腸癌、肝癌以及腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)［6-8］；在U251腫瘤細(xì)胞中，由于miR-130b高表達(dá)等因素的作用，PPAR-γ呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)；提高PPAR-γ的表達(dá)可以有效降低腫瘤的增殖和生長(zhǎng)，加速腫瘤凋亡［9-10］。與提高其表達(dá)相似，通過(guò)藥物激活腫瘤細(xì)胞中的PPAR-γ受體也可以有效抑制細(xì)胞增殖、從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。具體機(jī)制包括以下幾類：激活PPAR-γ可以抑制細(xì)胞周期蛋白激酶Cdk4的活性，提高對(duì)Cdk4活性具有抑制作用的其他蛋白，例如p19、p21以及p27的表達(dá)，影響細(xì)胞的分裂過(guò)程［11］；其次，激活PPAR-γ可以降低抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的含量，提高凋亡相關(guān)酶類Caspase-3 和 Caspase-7的活化，又到細(xì)胞凋亡［12］。此外，激活PPAR-γ可以降低COX-2、VEFG以及炎癥因子的表達(dá)，抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管新生，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，從而抑制腫瘤的進(jìn)展［13］。

姜黃素是莪術(shù)的主要有效成分之一，體外研究表明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有良好的抑制作用。研究結(jié)果表明，姜黃素的體外抗腫瘤作用與激活PPAR-γ有關(guān)。在姜黃素的作用下，U251細(xì)胞中PPAR-γ基因表達(dá)明顯提高；細(xì)胞周期分析表明大多數(shù)細(xì)胞位于sub-G0期以及G0/G1期，其形成原因可能與姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制Cdk4活性有關(guān)。上述研究結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致。為了進(jìn)一步證明其作用靶點(diǎn)位于PPAR-γ，用特異性抑制劑GW9662與姜黃素共同處理細(xì)胞，結(jié)果表明姜黃素對(duì)U251細(xì)胞的殺傷作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用以及提高PPAR-γ表達(dá)的作用均明顯減弱。以上結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)PPAR-γ與姜黃素對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有關(guān)。值得注意的是，在GW9662存在的條件下，姜黃素依然具有一定的體外抗腫瘤活性，推測(cè)其抗腫瘤作用還可能還存在其他機(jī)制。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)與ATP的相似性，推測(cè)其作用靶標(biāo)可能還包括激酶等，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素可以提高膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用于激活PPAR-γ有關(guān)。