孫海偉 田蒼祥 張虹 孫陽陽 張攀 周波 尚濤 曹德航

摘要：本研究通過對山東茶區(qū)的20個(gè)茶樹無性系品種（系）進(jìn)行SRAP親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)：新選育品種碧霞春與農(nóng)抗早有極高的遺傳相似性。引進(jìn)品系毛頭種，雖然由浙江地方選育，但其與烏龍茶系列品種親緣關(guān)系較近。舒茶早、平陽特早、金萱與其它品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形成單獨(dú)的各類。

關(guān)鍵詞：茶樹;品種（系）;親緣關(guān)系;SRAP

中圖分類號(hào)：S571.103文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0018-05

Genetic Relationship Analysis of New

Tea Varieties （Lines） by SRAP Marker

Sun Haiwei??Tian Cangxiang??Zhang Hong??Sun Yangyang

Zhang Pan??Zhou Bo3， Shang Tao3， Cao Dehang3

（1.Taishan Academy of Forestry Science， Taian 271000， China; 2.Jinan Yushuchun Tea Co.， Ltd.，

Jinan 250309， China; 3.Taian Agricultural Bureau， Taian 271000， China）

AbstractThe genetic relationship of 20 tea clone varieties （lines） in Shandong tea area were analyzed by SRAP marker. It was found that the new variety Bixiachun had very high genetic similarity with Nongkangzao. The introduced line Maotouzhong was bred in Zhejiang Province， but it had close relationship with Oolong tea series varieties. Shuchazao， Pingyangtezao and JinXuan were classified in a category with distant genetic relationship with the other varieties （lines）.

KeywordsTea tree; Variety （line）; Genetic relationship; SRAP

山東省“南茶北引”先后引進(jìn)福建福鼎大白種、浙江鳩坑種、安徽黃山群體種以及湖南、江蘇等多地?zé)o性系品種，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，山東茶區(qū)茶葉引進(jìn)栽培品種達(dá)到75個(gè)[1，2]，其中國家級(jí)良種40個(gè)，省級(jí)良種14個(gè)，地方良種21個(gè)。雖然品種多，但主栽品種仍以鳩坑種、福鼎大白種、黃山群體種等種子苗為主，無性系良種比例不高。1997年以來，泰山林業(yè)科學(xué)研究院針對生產(chǎn)中引種適應(yīng)性差、移栽成活率低等問題，經(jīng)過實(shí)生選種、優(yōu)株優(yōu)系篩選、良種引進(jìn)等工作，分別在泰山林業(yè)科學(xué)研究院、濟(jì)南玉樹春茶業(yè)有限公司基地、泰安市岱岳區(qū)山口鎮(zhèn)建立茶樹種質(zhì)資源圃和優(yōu)系（品種）對比園，收集國內(nèi)主要茶區(qū)的茶樹品種、茶優(yōu)系等共計(jì)27個(gè)。通過建立山東適制綠茶品種的篩選評價(jià)指標(biāo)和體系，利用最大隸屬度模糊綜合評價(jià)，篩選出適宜山東茶區(qū)栽培的綠茶適制品種和品系7個(gè)[3-6]，其中選育出自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種1個(gè)碧霞春（羅漢3號(hào)），地方新品系1個(gè)毛頭種。

SRAP標(biāo)記不僅能進(jìn)行遺傳多樣性研究，也能用于資源的分子鑒別，是研究茶樹遺傳多樣性的有效手段[7，8]。本試驗(yàn)對表現(xiàn)優(yōu)良的20個(gè)無性系茶樹良種與自選品系在不同立地條件下建立品種（系）對比園，并對其親緣關(guān)系進(jìn)行SRAP分析，以期了解選育和引進(jìn)茶樹種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳背景。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2018年6月21日在試驗(yàn)園分別選取20個(gè)品種（系）的一芽一葉幼嫩組織20個(gè)，編號(hào)后交由山東諾丁生物科技有限公司開展SRAP分析。具體品種編號(hào)及來源見表1。

1.2茶樹品種（系）DNA提取、擴(kuò)增和電泳檢測

DNA提取采用CTAB法[9]，同時(shí)對提取的DNA樣品分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測后，將提取的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00 μL TE溶液中于-20℃保存。

PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 3 μL，25 ng·μL-1 DNA 1 μL，5 μmol·L-1 上、下游引物各1.5 μL，5 U·μL-1 Taq酶 0.3 μL，用ddH?2O補(bǔ)足體積。

SRAP擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán);94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒定功率 50 W 電泳 1.5 h，利用銀染法進(jìn)行染色，后掃描保存圖片。

1.3SRAP引物 ?參照 Li 等[10]的引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物10組（表2，表3），對20個(gè)樣品進(jìn)行SRAP擴(kuò)增。

1.4電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)及處理分析

根據(jù)PAGE電泳結(jié)果，凝膠相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，形成SRAP指紋圖譜。利用POPGENE軟件計(jì)算每對SRAP引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率，等位基因數(shù)Na，有效等位基因數(shù)Ne，各材料間的 Neis 遺傳相似系數(shù) （GS），Neis遺傳多樣性指數(shù)（H）和Shannons信息指數(shù)（I），并利用 NTSYSpc version 2.10e 軟件根據(jù) Neis 遺傳相似系數(shù)采用 UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.120個(gè)茶樹品種（系）DNA提取質(zhì)量

茶葉富含多酚，一般的提取試劑盒提取完整性比較差，采用CTAB法提取的茶葉DNA條帶完整，拖尾現(xiàn)象少，DNA沒有降解，電泳結(jié)果如圖1，保證了SRAP的準(zhǔn)確性。

2.2不同引物對20個(gè)茶樹品種（系）SRAP擴(kuò)增效果

利用10對引物對20種檢測樣本DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，并進(jìn)行PAGE電泳分析。PAGE電泳檢測提高多態(tài)位點(diǎn)的分辨率，共擴(kuò)增出256個(gè)位點(diǎn)，條帶大小分布在40～500 bp之間，多態(tài)差異性明顯，后續(xù)數(shù)據(jù)分析可靠。圖2為引物組合P1的擴(kuò)增結(jié)果。

2.320個(gè)茶樹品種（系）的指紋圖譜

指紋圖譜直接反映生物個(gè)體在DNA水平上的差異，可有效鑒別茶樹品種，保護(hù)品種權(quán)。為標(biāo)記一下我們新選育的茶樹品種碧霞春，根據(jù)各對引物組合的穩(wěn)定性、多態(tài)位點(diǎn)百分率、有效等位位點(diǎn)數(shù)和其對品種的鑒別能力，篩選出3 對引物組合P1、P2、P9用于茶樹品種指紋圖譜的構(gòu)建。將代表等位基因位點(diǎn)有無的1和0按順序組成數(shù)字指紋，建立了20個(gè)茶樹品種的指紋圖譜（表4）。

2.420個(gè)茶樹品種（系）的親緣關(guān)系分析

利用10對引物在20個(gè)樣品中獲得256條擴(kuò)增片段，在POPGENE軟件中計(jì)算10對引物的多樣性指數(shù)（表5）。20個(gè)茶樣品等位基因平均數(shù)（Na）介于1.8077和1.9630之間，平均值為18919;有效等位基因數(shù)（Ne）介于1.3676和1.6707之間，平均值為1.4644;Neis遺傳多樣性（H）介于0.2196和0.8930之間，平均值為0.3372;Shannons信息指數(shù)（I）介于0.3427～0.5499，平均值為0.4215;多態(tài)位點(diǎn)最多達(dá)到31個(gè);多態(tài)百分?jǐn)?shù)介于84.85%～96.30%，平均值為89.99%。

利用數(shù)據(jù)，在NTSYS軟件中計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS值），得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近;遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表6可以看出，?9號(hào)和10號(hào)遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)到0.9688，9號(hào)為自選碧霞春，10號(hào)為農(nóng)抗早，說明兩者親緣關(guān)系很近。10號(hào)和12號(hào)間遺傳相似系數(shù)最小，為0.6211，說明農(nóng)抗早和舒茶早親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在遺傳相似系數(shù)0.6988處，大體可以將20個(gè)品種聚為5類（圖3），其中A類有8個(gè)品種，以烏龍茶系列品種為主，分別為水仙、瑞香、大紅袍、本山、肉桂、梅占、黃觀音、毛頭種;B類有9個(gè)品種，以來自浙江、湖南、安徽的綠茶品種為主，分別為中茶102、龍井長葉、龍井43、中茶108、玉綠、碧香早、碧霞春、農(nóng)抗早、勁峰，新選育品種碧霞春與農(nóng)抗早親緣關(guān)系較近;C類有1個(gè)品種，為金萱;D類有1個(gè)品種為平陽特早;E類有1個(gè)品種為舒茶早。

3討論與結(jié)論

自選新品系碧霞春母樹為 “南茶北引”時(shí)期從山東泰山櫻桃園栽培的黃山群體種實(shí)生單株的雜交后代中獲得，該品系有較強(qiáng)的抗寒性和抗病蟲特性。從遺傳相似系數(shù)可以看出，碧霞春和農(nóng)抗早遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.9688，而農(nóng)抗早來源于安徽，進(jìn)一步證實(shí)碧霞春來自安徽品種群后代的可能性大;農(nóng)抗早和舒茶早之間遺傳相似系數(shù)最小，為0.6211，說明兩品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

試驗(yàn)選用的20個(gè)品種（系）大體可以聚為5類，引進(jìn)品系毛頭種，雖然來自浙江，但其與烏龍茶系列品種親緣關(guān)系較近。舒茶早、平陽特早、金萱與其余品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形成單獨(dú)的各類。金萱雖然是來自臺(tái)灣的烏龍茶品種，但與試驗(yàn)的6個(gè)烏龍茶品種水仙、瑞香、大紅袍、本山、梅占、黃觀音親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

山東茶樹栽培歷史較短，茶樹良種選育工作與浙江、安徽、湖南等主產(chǎn)區(qū)相比起步較晚。本研究所選用的20個(gè)茶樹品種（系）是在山東有較強(qiáng)適應(yīng)性的代表品種，也有一定栽培面積，通過遺傳多樣性分析說明其遺傳多樣性水平較高，揭示其遺傳變異較為豐富。這些豐富的種質(zhì)資源為山東選育當(dāng)家良種儲(chǔ)備了眾多優(yōu)良親本，且親本遺傳基礎(chǔ)強(qiáng)大，避免了遺傳背景過于單一的問題。

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