劉 磊,盧冰霞,陳忠偉,秦毅斌,段群棚,周英寧,何 穎,李 斌,梁家幸,閉炳芬,蔣冬福,盧敬專(zhuān),楊思儀,蘇乾蓮,趙 武
(廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001)
2015年6月,美國(guó)北卡羅來(lái)納州一規(guī)?;i場(chǎng)暴發(fā)PDNS(豬皮炎腎病綜合征)疫情。Palinski等[1]借助新一代測(cè)序(NGS)技術(shù),從發(fā)病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出PCV3。隨后包括美國(guó)、韓國(guó)、意大利、巴西以及中國(guó)的華南、華中和華北多省市都有PCV3流行的報(bào)道。PCV3感染可引起豬的皮炎腎病綜合征、種豬繁殖障礙及包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),給全世界的生豬養(yǎng)殖造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。作為一種新動(dòng)物病原體,PCV3對(duì)豬的致病性、其在圓環(huán)病毒相關(guān)疾病中的作用以及其與其他病原的混合感染及互相作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
2018年11月28日,廣西一存欄1 000頭母豬場(chǎng)突然出現(xiàn)懷孕后期母豬流產(chǎn),每天2~5頭母豬流產(chǎn)。母豬流產(chǎn)前不食,體溫正常,流產(chǎn)后很快恢復(fù)采食。12月3日豬場(chǎng)將其中2窩流產(chǎn)胎兒送往廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室進(jìn)行檢測(cè),剖檢發(fā)現(xiàn)胎兒腦充血、肺臟充血出血、腎臟有針尖大的出血點(diǎn)、全身多處淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果表明,PCV3感染可能是引起本次母豬流產(chǎn)的主要原因?,F(xiàn)將該病例的檢測(cè)報(bào)告如下。
流產(chǎn)胎兒2窩,每窩3頭,共6頭,由廣西某豬場(chǎng)送往本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。
病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品;2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產(chǎn)品;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)為北京陸橋公司產(chǎn)品;HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品;DL 2 000 DNA Marker為T(mén)akala公司產(chǎn)品。
參考文獻(xiàn)[2],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成PCV3檢測(cè)引物,PCR擴(kuò)增核苷酸預(yù)期為649 bp。引物序列:P1:5'-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3';P2:5'-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3'。
用無(wú)菌接種環(huán)采取流產(chǎn)胎兒腦、腎臟、脾臟和肺臟接種到TSA平板培養(yǎng)基上,放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后,看是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。
1.5.1 病料處理 每窩流產(chǎn)胎兒(3頭)混為一份進(jìn)行處理,無(wú)菌條件下采取流產(chǎn)胎兒的腦、肝臟、肺臟和脾臟等部位按照1∶3添加滅菌的PBS溶液,用勻漿器進(jìn)行研磨;懸液反復(fù)凍融3次;12 000 r/min離心5 min,取上清液用于下一步DNA/RNA的提取。
1.5.2 DNA/RNA的提取 處理好的組織病料按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA/RNA提取,所獲得的DNA用于下一步的PCR反應(yīng)或置于-80℃保存,備用;所獲得的RNA用于下一步的RT-PCR,或置于-80℃保存,備用。
1.5.3 PCR/RT-PCR檢測(cè) 通過(guò)PCR/RT-PCR的方法檢測(cè)流產(chǎn)胎兒腦及內(nèi)臟組織樣品中是否有CSFV(豬瘟病毒)、PRRSV(豬藍(lán)耳病病毒)、JEV(豬乙腦病毒)、PRV(豬偽狂犬病病毒)、PPV(豬細(xì)小病毒)、PCV2(圓環(huán)病毒2型)和PCV3等這些可能引起母豬流產(chǎn)的病毒存在。參考羅廷榮等[3]建立的CSFV RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為478 bp;參考韋瑩等[4]建立的PRRSV RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為443 bp;參考李茂寧等[5]建立的JEV RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為228 bp;參考周復(fù)春[6]建立的PRV PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為217 bp;參考于新友等[7]建立的PPV PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為475 bp;參考李瑩瑩[8]建立的PCV2 PCR檢測(cè)方法對(duì)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為1 154 bp;參考賀會(huì)利等[2]建立的PCV3對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),目的片段大小為649 bp。
在TSA培養(yǎng)基上未有任何菌落生長(zhǎng)。
組織樣品PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,送檢的2窩流產(chǎn)胎兒 CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2 均為陰性,而PCV3均為陽(yáng)性,結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。將該P(yáng)CV3陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI里進(jìn)行Blast,結(jié)果顯示測(cè)序所得核苷酸序列與NCBI上登錄的其他PCV3同源性在97.8%~99.7%之間,表明該流產(chǎn)胎兒感染PCV3。
圖1 流產(chǎn)胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖2 流產(chǎn)胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
在養(yǎng)豬生產(chǎn)中能夠引起妊娠母豬流產(chǎn)的原因有很多,營(yíng)養(yǎng)原因、機(jī)械損傷原因、應(yīng)激原因、疾病原因以及不合理的用藥等都可能造成妊娠母豬流產(chǎn)。2018年11月底廣西某豬場(chǎng)連續(xù)數(shù)日出現(xiàn)多頭妊娠后期母豬流產(chǎn)現(xiàn)象。養(yǎng)豬場(chǎng)在出現(xiàn)流產(chǎn)前的1周內(nèi)懷孕母豬未進(jìn)行過(guò)疫苗免疫和群體用藥,母豬群也未表現(xiàn)出外陰紅腫、脫肛等霉菌毒素中毒的現(xiàn)象,豬群在出現(xiàn)流產(chǎn)前也未受到大的應(yīng)激。在排除霉菌毒素中毒、用藥不當(dāng)和管理不當(dāng)造成的應(yīng)激等可能的原因后,懷疑是疾病因素造成的妊娠母豬流產(chǎn)。2018年12月3日豬場(chǎng)將流產(chǎn)胎兒送本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。
隨著PCV3在國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)流行的報(bào)道,其致病性也越來(lái)越受到更多學(xué)者的關(guān)注。2017年6月Faccini等[9]收集了意大利不同地區(qū)豬群中共計(jì)16份流產(chǎn)胎兒或死胎組織,流產(chǎn)胎兒和死胎的腦、淋巴、心臟等組織內(nèi)均檢測(cè)出PCV3,病毒滴度為 1×109~1×1010copies/g,而其他相關(guān)病原體檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明PCV3可能與繁殖障礙相關(guān)。同年8月,Tochetto等[10]從巴西一農(nóng)場(chǎng)出現(xiàn)繁殖障礙的母豬血清內(nèi)檢測(cè)到了PCV3并進(jìn)行了全基因的擴(kuò)增,而從同一農(nóng)場(chǎng)正常生產(chǎn)的母豬血清中未檢測(cè)到PCV3,結(jié)果也提示PCV3可能與該農(nóng)場(chǎng)的母豬繁殖障礙有關(guān)。為了解引起廣西某規(guī)模化豬場(chǎng)母豬流產(chǎn)的病因,本實(shí)驗(yàn)室采用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定;采用PCR/RT-PCR方法檢測(cè)可能與母豬流產(chǎn)相關(guān)的病毒如CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2和 PCV3。結(jié)果在流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟組織中未分離到細(xì)菌;2份流產(chǎn)胎兒的內(nèi)臟組織中都檢測(cè)到PCV3,而其他病原均為陰性,提示PCV3感染可能是引起本次母豬流產(chǎn)的主要原因,提示PCV3也是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)的重要病原,應(yīng)引起業(yè)界的警惕重視,并加以防范這一新發(fā)疫病。