■ 吳桐強(qiáng) 胡 毅 * 鐘 蕾 陳 團(tuán) ，3 陳云飛 ，3 曹曉莉 戴振炎

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；3.通威股份有限公司，四川成都 610041）

碳水化合物是為生命體提供熱能的三種主要營(yíng)養(yǎng)素中最廉價(jià)的營(yíng)養(yǎng)素。在魚體內(nèi)，碳水化合物作為能量消耗的利用較蛋白質(zhì)和脂肪低。而相對(duì)于蛋白質(zhì)和脂肪，碳水化合物則容易獲得，且能顯著降低飼料成本。但是，攝入高碳水化合物通常會(huì)導(dǎo)致魚體出現(xiàn)肝腫大、肝糖原累積、生長(zhǎng)性能下降[1]，并且認(rèn)為，魚類耐糖機(jī)能低下的原因是胰島素量分泌不足導(dǎo)致的[2]。然而也有大量的研究認(rèn)為參與魚類糖類代謝的酶也是其中的主要影響因素。在大菱鲆上的研究得出，GK在高糖情況下(添加量為28%)活性呈下降趨勢(shì)，PK也出現(xiàn)了類似的情況[3]。對(duì)翹嘴紅鲌的研究表明，攝食高碳水化合物飼料可提高GK的活性及基因的表達(dá)[4]。草魚因易飼養(yǎng)、草食性、生長(zhǎng)快、群體產(chǎn)量高，近年來(lái)已成為淡水養(yǎng)殖的當(dāng)家品種之一。與肉食性和雜食性魚類相比，草食性魚類對(duì)糖的利用較高。研究發(fā)現(xiàn)，草魚能夠利用飼料中37%～56%的碳水化合物水平，對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響[5]。然而，在本試驗(yàn)的前期研究中，當(dāng)飼料碳水化合物水平高于37%后，草魚增重率下降，同時(shí)，肝體比和肝糖原含量升高，顯著影響了草魚的生長(zhǎng)性能[6]。鑒于此，本試驗(yàn)以小麥和小麥麩為碳水化合物源，研究了高碳水化合物水平（CHO＞37%）對(duì)大規(guī)格草魚糖代謝相關(guān)的激素和酶的影響，為探索高糖水平下，大規(guī)格草魚生長(zhǎng)性能下降提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料配制

以小麥和小麥麩為主要糖源，玉米蛋白粉、進(jìn)口DDGS、豆粕和菜粕為蛋白源，保持每種飼料蛋白源在總蛋白源中比例一致，試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理組，設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30%、28%、26%、24%、22%、20%、18%，碳水化合物（無(wú)氮浸出物）水平依次為31%、34%、37%、40%、43%、46%、49%，配制成7種全價(jià)配合膨化飼料，分別為P30C31(C1組)、P28C34(C2組)、P26C37(C3組)、P24C40(C4組)、P22C43(C5組)、P20C46(C6組)、P18C49(C7組)。試驗(yàn)飼料由通威股份有限公司南昌分公司提供，飼料原料使用利達(dá)超微粉碎機(jī)粉碎，粉碎細(xì)度達(dá)到80%，過(guò)80目篩，通過(guò)牧羊混合機(jī)，混合均勻度為5.2%，最后通過(guò)恒潤(rùn)145雙螺桿膨化機(jī)膨化，制作粒徑為4.0的膨化飼料，試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平如表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在湖南省婁底市新化縣車田江水庫(kù)網(wǎng)箱進(jìn)行。試驗(yàn)魚種購(gòu)于湖南省岳陽(yáng)市湘陰縣某苗種場(chǎng)，魚種暫養(yǎng)于5 m×4 m×5 m的網(wǎng)箱中。試驗(yàn)網(wǎng)箱采用聚乙烯網(wǎng)箱，大小為2 m×2 m×2 m。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)挑選規(guī)格均勻、體格健康的草魚分兩輪進(jìn)行分箱，試驗(yàn)共7個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)平行，共21個(gè)網(wǎng)箱，每個(gè)網(wǎng)箱放草魚30尾，魚初始體重為(398.6±5.9)g。試驗(yàn)期間水溫為（26.1±2.12）℃。溫度低于25℃時(shí)以草魚體重的1%～2%投喂，日投喂兩次（8：30～10：00、15：30～17：00），早晚比例為40%、60%；水溫高25℃時(shí)以草魚體重的3%投喂，日投喂三次（7:00～8：00、11：00～12:00、17：00～18：00），早中晚比例為20%、35%、45%。投喂方法為人工手撒，每次分多批投喂。每天記錄天氣、水溫、草魚的攝食以及死亡情況。試驗(yàn)周期為16周。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，從每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)抽取6尾草魚，用丁香油麻醉（1∶10 000）后從尾靜脈取血，裝于1.5 ml離心管中4℃靜置過(guò)夜，然后3 000 r/min離心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，用于血清胰島素和胰高血糖素的測(cè)定；根據(jù)前期研究結(jié)果，高碳水化合物水平飼料會(huì)導(dǎo)致魚體肝體比、臟體比、腸體比以及肌肉和肝臟脂肪含量升高（胡毅，2018）[6]，因此選擇正常碳水化合物水平C1（CHO 31%）、C2（CHO 34%）、C3（CHO 37%）組和高碳水化合物水平C7（CHO 49%）組，解剖腹腔，取出完整的內(nèi)臟，分離出肝臟，保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定肝臟糖代謝酶活性。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血清胰島素和胰高血糖素的測(cè)定

血清胰島素和胰高血糖素含量均采用上海研輝生物科技公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 肝臟酶活性測(cè)定

稱取一定重量的肝臟，用PBS溶液清洗肝臟組織，然后將肝臟組織放入10 ml的勻漿管中，按1∶9的比例加入9倍體積的PBS（pH值7.4），用勻漿器將組織勻漿充分。3 000 r/min 4℃離心20 min，收集上清液用于草魚肝臟糖代謝相關(guān)酶的測(cè)定。己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖激酶（GK）、磷酸果糖激酶（PFK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、1,6-二磷酸果糖酶（FBPase）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的測(cè)定均采用上海研輝生物科技公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan's法多重比較組間差異性，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對(duì)大規(guī)格草魚糖代謝激素的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 不同碳水化合物水平飼料對(duì)大規(guī)格草魚血清胰島素和胰高血糖素的影響

由圖1可知，投喂不同碳水化合物日糧16周后，與正常C1～C3(31%～37%CHO)組相比，高碳水化合物C4～C7(40%～49%CHO)組草魚血清胰島素、胰高血糖素含量呈升高趨勢(shì)，其中C4組胰島素含量顯著高于C3組(P＜0.05)，C4和C7組胰高血糖素含量顯著高于正常組(P＜0.05)。

2.2 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對(duì)大規(guī)格草魚肝臟糖酵解指標(biāo)的影響(見(jiàn)圖2)

由圖2可知，各飼料組碳水化合物水平對(duì)PFK、PK活性無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。與正常C3(37%CHO)組相比，高碳水化合物C7(49%CHO)組GK活性顯著降低(P＜0.05)。與正常C1、C3(31%、37%CHO)組相比，高碳水化合物C7(49%CHO)組HK活性顯著降低(P＜0.05)。

2.3 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對(duì)大規(guī)格草魚肝臟糖異生指標(biāo)的影響（見(jiàn)圖3）

圖2 不同碳水化合物水平飼料對(duì)大規(guī)格草魚GK、HK、PFK和PK活性的影響

圖3 飼料中不同糖源及水平對(duì)大草魚中肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的影響

由圖3可知，各飼料組碳水化合物水平對(duì)PEPCK無(wú)顯著影響（P＞0.05）。在正常C1～C3(31%～37%CHO)組，F(xiàn)BPase的活性呈升高趨勢(shì)，且C3組顯著高于C1組（P＜0.05）。而在高碳水化合物C7(49%CHO)組，F(xiàn)BPase的活性則呈降低趨勢(shì)。在正常C3(37%CHO)組中，G-6-Pase活性呈上升的趨勢(shì)，而繼續(xù)升高碳水化合物水平C7(49%CHO)組對(duì)G-6-Pase活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 高碳水化合物水平膨化飼料對(duì)大規(guī)格草魚糖代謝激素的影響

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。在哺乳動(dòng)物中，胰島素是主要的合成代謝激素刺激餐后葡萄糖被外周組織如肝、骨骼肌和脂肪組織吸收。在魚類上面，則差異較大。在歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)[7]和異育銀鯽(Caras?sius auratus gibelio bloch)[8]中的研究發(fā)現(xiàn)，攝食高碳水化合物飼料，能夠顯著提高魚血清中的胰島素水平。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致，結(jié)果表明，大草魚飼料中較高的碳水化合物水平促進(jìn)了胰島素的分泌。然而，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[9]上面的研究則得出攝食高糖飼料對(duì)分泌胰島素的β細(xì)胞并無(wú)影響，高碳水化合物并不能顯著促進(jìn)胰島素的分泌。目前，膳食碳水化合物水平對(duì)胰島素釋放的影響存在著爭(zhēng)議。胰島素的釋放受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激。在本研究中，血漿胰島素水平和血糖似乎是不相關(guān)的，試驗(yàn)前期研究顯示，在喂食含碳水化合物8周后的大草魚后，血液中的葡萄糖無(wú)顯著差異[6]。因此，本試驗(yàn)的胰島素并未受到血糖的調(diào)節(jié)作用，而可能是胰高血糖素的分泌促進(jìn)了胰島素的釋放，亦或者類似于精氨酸類的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更能夠?qū)σ葝u素的分泌起到促進(jìn)作用[10]。魚類胰高血糖素同樣受到飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)。一般認(rèn)為，魚類攝入葡萄糖后，會(huì)抑制胰高血糖素的分泌。在本試驗(yàn)中，胰高血糖素與胰島素有著同樣的趨勢(shì)，高碳水化合物水平促進(jìn)了胰高血糖素的分泌。說(shuō)明胰高血糖素并未受到血糖的調(diào)節(jié)。其原因可能與哺乳動(dòng)物類似，血漿中的氨基酸水平更能夠促進(jìn)魚類胰高血糖素水平[11]。

3.2 高碳水化合物水平膨化飼料對(duì)大規(guī)格草魚肝臟中糖代謝相關(guān)酶活性的影響

在糖代謝機(jī)理中，糖酵解起分解糖的作用，而糖異生則扮演糖合成的角色,兩者相互作用，才能起到維持血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。調(diào)節(jié)魚類糖酵解的關(guān)鍵酶為己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK),調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)。

魚體對(duì)碳水化合物利用低的原因,被認(rèn)為是魚類GK缺乏或活性很低[12]。近來(lái)的研究表明魚類肝臟中存在GK，日糧中碳水化合物能誘導(dǎo)翹嘴紅鲌(Culter?alburnus Basilewsky)[13]、吉富羅非 魚(GIFT Oreochro?mis niloticus)[14]、瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）[15]、南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]、青魚（Mylopharyn?godn piceus）和鯽（C.anratus）[17]的GK表達(dá)量，且高碳水化合物飼料顯著增加了肝臟GK的表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大草魚膨化飼料中碳水化合物水平為37%時(shí)，大草魚能夠誘導(dǎo)GK活性的提高。而當(dāng)飼料碳水化合物水平從37%增加至49%時(shí)，GK活性則顯著下降。在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]中也有類似的研究結(jié)果。推測(cè)可能是膨化飼料更易于魚體對(duì)碳水化合物的消化吸收，而使得大規(guī)格草魚對(duì)碳水化合物的需求更低，因此過(guò)高的碳水化合物則抑制了GK的表達(dá)。有研究表明，HK非常保守,不受營(yíng)養(yǎng)狀況和飼料碳水化合物的誘導(dǎo)[3，13，16]。在本研究中大草魚肝臟HK活性隨著膨化飼料中碳水化合物水平的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，說(shuō)明膨化飼料中碳水化合物能夠誘導(dǎo)大草魚肝臟中HK活性的變化。但是碳水化合物水平達(dá)到37%以后，升高碳水化合物水平HK則顯著下降。因此，可認(rèn)為是大規(guī)格草魚對(duì)高糖飼料的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在大黃魚（Larimichthys crocea）[18]的研究中也得出了類似的結(jié)果，在高糖水平下，HK的活性降至最低點(diǎn)。在大草魚試驗(yàn)中，PK和PFK活性不受飼料糖含量的誘導(dǎo)，這分別與大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]等中的研究結(jié)果一致。

有研究指出，魚類攝食高碳水化合物飼料后FBPase活性無(wú)顯著變化[19]。本試驗(yàn)大規(guī)格草魚肝臟FBPase活性隨著膨化飼料中碳水化合物水平的升高不斷上升，但碳水化合物水平升至49%時(shí)，F(xiàn)BPase的活性則呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明膨化飼料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性。這與在團(tuán)頭魴(Megalo?brama amblycephala)[20]上的研究結(jié)果相似。一般認(rèn)為，高碳水化合物水平能夠抑制葡萄糖異生，然而魚類肝臟中G-6-Pase的活性卻能隨飼料碳水化合物的增加而增強(qiáng)[21]。但是在鯉魚（Cyprinus carpio）[22]和大黃魚（Larimichthys crocea）[18]中的研究表明，G-6-Pase活性與日糧碳水化合物水平之間存在負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)中，隨著碳水化合物水平升高，G-6-Pase活性呈升高的趨勢(shì)，而C7組G-6-Pase活性與C3組無(wú)顯著差異，但是有上升的趨勢(shì)。說(shuō)明G-6-Pase能夠隨著碳水化合物水平的升高而升高，但是高糖下，大規(guī)格草魚能夠調(diào)控G-6-Pase活性的異常升高。FBPase是調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵酶，G-6-Pase是糖異生的第一個(gè)限速酶，膨化飼料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性且G-6-Pase活性并無(wú)顯著升高，說(shuō)明大規(guī)格草魚體內(nèi)的糖異生調(diào)節(jié)機(jī)制比較完善。PEPCK是肝和腎中糖元異生的關(guān)鍵酶[23]。研究認(rèn)為，低碳水化合物的飼料更能顯著提高PEPCK的活性[24]。在瓦氏黃顙魚[15]（Pelteobagrus vachelli）的研究中也得出了類似的結(jié)論，PEPCK的相對(duì)表達(dá)量，隨著飼料糖含量的增加呈下降趨勢(shì)。然而本實(shí)驗(yàn)中，飼料中碳水化合物水平的增加對(duì)大草魚肝臟PEPCK無(wú)顯著影響。出現(xiàn)這種差異的原因可能跟魚的種類亦或者不同的糖源有關(guān)，具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

綜合考慮膨化飼料中碳水化合物水平對(duì)大規(guī)格草魚胰島素、胰高血糖素、糖代謝酶的影響，認(rèn)為大規(guī)格草魚飼料中碳水化合物的適宜水平為37%，過(guò)高的碳水化合物水平會(huì)對(duì)肝臟糖酵解存在一定程度的抑制，不利于大規(guī)格草魚機(jī)體對(duì)于碳水化合物的調(diào)節(jié)。因此長(zhǎng)期攝食高糖水平的膨化飼料可能會(huì)影響大規(guī)格草魚正常的生理功能。