陰 月 王麗雪 董 寧 吳 瑤 童亞林 祝筱梅 姚詠明

（1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2. 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 100048；3. 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二四醫(yī)院燒傷整形科，廣西 桂林 541002）

膿毒癥是創(chuàng)燒傷、休克、感染等臨床急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[1]，病情進(jìn)展迅速、預(yù)后兇險(xiǎn)。近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到，免疫功能紊亂可能是膿毒癥的發(fā)病本質(zhì)及病情進(jìn)展的重要內(nèi)因[2-3]，但其主要作用環(huán)節(jié)及有效調(diào)控途徑仍不清楚。白細(xì)胞介素（IL）-33 是IL-1 家族新成員，在Ⅱ型免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]，與感染狀態(tài)下免疫抑制密切相關(guān)[5]。本研究旨在探討膿毒癥時(shí)IL-33 對(duì)體內(nèi)專職抗原呈遞細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）免疫功能的影響與意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BALB/c 小鼠，雄性，6 ～8 周，（20±2）g，購(gòu)自北京華阜康公司。重組鼠IL-33蛋白和重組鼠可溶性IL-33 受體（sST2）蛋白（美國(guó)R&D Systems 公司），藻紅蛋白- 花青素7（PE-Cy7)或別藻藍(lán)蛋白（APE）標(biāo)記CD80 抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記CD86 抗體及異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）抗體（美國(guó)Biolegend 公司），IL-33 抗體（美國(guó)Abcam 公司），小鼠CD11c 陽(yáng)性選擇試劑盒（EasySepTMMouse CD11c Positive Selective Kit Ⅱ，加拿大StemCell 公司），β-actin（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），RIPA 裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑混合物、磷酸酶抑制劑混合物、超敏發(fā)光液A 和B 液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），電泳儀（DYY-7，北京六一廠），凝膠成像系統(tǒng)Image Quant LAS 4000 （美國(guó)GE 公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠膿毒癥模型復(fù)制及動(dòng)物分組 小鼠隨機(jī)分為3 組：假傷組、盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）組和sST2 干預(yù)組。CLP 組復(fù)制小鼠膿毒癥模型：小鼠禁食12 h，正常飲水；5%水合氯醛（200 μl/20 g）腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)板上，用碘伏棉球在腹中部消毒3 次；沿腹中線剪開(kāi)約0.5 cm 開(kāi)口，暴露腹膜，再略微剪開(kāi)暴露腹腔，在左上腹尋找盲腸，暴露盲腸；在盲腸1/2 處結(jié)扎，用針頭在結(jié)扎段盲腸1/2 處貫穿1 次，擠出少許內(nèi)容物，將盲腸放回腹腔中，將腹膜和皮膚逐層縫合，輕揉腹部防止腸管梗阻；術(shù)后即刻頸下注射生理鹽水1 ml。sST2干預(yù)組于CLP 術(shù)后1 h 經(jīng)腹腔注射重組sST2（每只10 μg，溶于200 μl PBS 中），CLP 組則給予200 μl PBS 腹腔注射；假傷組動(dòng)物僅開(kāi)腹暴露盲腸，不結(jié)扎穿孔，其余操作同CLP 組。

1.2.2 分離脾臟DC 取小鼠脾臟置于PBS 中沖洗并去除筋膜，撕碎并研磨脾臟組織，經(jīng)70 μm 篩網(wǎng)過(guò)濾，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，按照小鼠CD11c 陽(yáng)性選擇試劑盒操作說(shuō)明，按比例依次加入各成分，充分反應(yīng)后以PBS 重懸調(diào)整至適當(dāng)體積并轉(zhuǎn)移至圓底試管，放入磁鐵中靜置3 min，然后使用磁鐵向一個(gè)方向迅速傾倒，倒掉液體，將試管取離磁場(chǎng)，輕彈管壁，加PBS 重懸，重復(fù)上述操作3 次。加PBS 重懸后1 500 r/min 離心 5 min，棄上清，收集細(xì)胞團(tuán)重懸，以FITCCD11c 標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 純度，結(jié)果顯示可達(dá)90%以上。

1.2.3 脾臟DC 表面標(biāo)志分子表達(dá)檢測(cè) 收集各觀察時(shí)間點(diǎn)小鼠脾臟DC，計(jì)數(shù)細(xì)胞每管2×105個(gè)，PBS 重懸吹散為單細(xì)胞懸液，按比例加入待測(cè)抗體（CD80、CD86 和MHC-Ⅱ抗體）混勻后4 ℃避光孵育30 min，PBS 潤(rùn)洗3 次，離心后加200 μl PBS 重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各標(biāo)記物表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)脾臟IL-33 蛋白表達(dá) 于各觀察時(shí)間點(diǎn)取小鼠脾臟組織稱重，按1 ∶10 比例加入配置好的RIPA 裂解混合液（RIPA 裂解緩沖液∶蛋白酶抑制劑混合物∶磷酸酶抑制劑混合物=97 ∶2 ∶1）裂解提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)至偏氟乙烯（PVDF）膜。用10% 脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，加IL-33 抗體（1 ∶1 000）、β-actin 抗體（1 ∶1 000）冰上孵育過(guò)夜。洗滌后，加二抗室溫孵育1 h。洗滌，超敏發(fā)光液A、B 液1 ∶1 混合，曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用ImageJ 進(jìn)行Western blot 灰度分析。采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，兩組間差異比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CLP 小鼠脾臟DC 表面標(biāo)志分子表達(dá)變化 CLP組小鼠分別在CLP 術(shù)后6、12、24、48、72 h 分離提取脾臟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 表面標(biāo)志分 子及共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)情況 （n=3）。結(jié)果顯示，與假傷組相比，CLP 術(shù)后除CD80 表達(dá)水平有所升高（P＜0.01）外，CD86 和MHC-Ⅱ表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.01），其中以術(shù)后72 h 降低尤為明顯（P＜0.01，見(jiàn)圖1）。提示膿毒癥造成小鼠脾臟DC 成熟分化異常，功能抑制。

圖1 CLP 后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟DC 表面標(biāo)志物表達(dá)變化（n=3）

2.2 CLP 小鼠脾臟IL-33 蛋白水平改變 復(fù)制小鼠膿毒癥模型，分別于CLP 術(shù)后6、12、24、48、72 h 和5 d 處死小鼠，提取脾臟組織蛋白，Western blotting 檢測(cè)小鼠脾臟IL-33 蛋白水平。結(jié)果顯示，小鼠脾臟組織中IL-33 在CLP 術(shù)后24 h 表達(dá)明顯增強(qiáng)，至72 h 仍持續(xù)于較高水平，CLP 術(shù)后5 d 表達(dá)逐漸降至正常范圍（見(jiàn)圖2）。

2.3 sST2 處理對(duì)小鼠生存率及脾臟DC 表面標(biāo)志分子的影響 動(dòng)物隨機(jī)分為CLP 組（10 只）和sST2 干預(yù)組（10 只），記錄小鼠死亡情況并于術(shù)后72 h 處死所有動(dòng)物（CLP 組4 只，sST2 干預(yù)組5 只），分離提取脾臟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 表面標(biāo)志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)變化。結(jié)果顯示，給予sST2 干預(yù)可以在一定程度上提高CLP 小鼠術(shù)后3 d 內(nèi)存活率（見(jiàn)圖3），并顯著上調(diào)CLP 小鼠術(shù)后72 h 脾臟DC 表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)水平（P＜0.01,見(jiàn)圖4）。

圖2 CLP 小鼠脾臟IL-33 蛋白水平改變（n=3）

圖3 sST2 干預(yù)對(duì)CLP 小鼠存活率的影響（n=10）

2.4 重組IL-33 對(duì)脾臟DC 功能狀態(tài)的直接影響 分離提取正常小鼠脾臟DC 體外培養(yǎng)，給予不同濃度重組IL-33（0、1、10、100 ng/ml）刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 表面標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，10 ng/ml 的IL-33 刺激24 h 后，CD80 表達(dá)水平略有降低但差異不顯著（P＞0.05），而CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)水平有明顯降低（P＜0.05，見(jiàn)圖5）。

3 討 論

膿毒癥是感染后宿主反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙[6]。隨著對(duì)膿毒癥發(fā)病本質(zhì)認(rèn)識(shí)的加深，人們注意到，機(jī)體免疫紊亂或免疫功能降低是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。處于免疫調(diào)控中心位置的專職抗原呈遞細(xì)胞DC 在創(chuàng)燒傷后免疫功能障礙發(fā)病機(jī)制中具有重要意義，其數(shù)量減少及功能受抑參與機(jī)體免疫異常反應(yīng)過(guò)程，在很大程度上影響著嚴(yán)重創(chuàng)（燒）傷感染并發(fā)癥的結(jié)局[3,7]。本組資料顯示，盡管CLP 小鼠脾臟DC 表面CD80表達(dá)在術(shù)后24 h 有所上調(diào)，CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)水平均顯著降低，成熟分化異常，處于功能抑制狀態(tài)。

圖4 sST2 干預(yù)對(duì)脾臟DC 表面標(biāo)志物的影響

圖5 重組IL-33 刺激對(duì)正常小鼠脾臟DC 表面標(biāo)志物表達(dá)水平的影響（n=3）

IL-33 是IL-1 家族成員之一[8]，主要由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，在組織損傷及細(xì)胞壞死時(shí)釋放至細(xì)胞外，除作為機(jī)體組織損傷的預(yù)警信號(hào)外，還可通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面ST2 受體調(diào)控條件性T 細(xì)胞[9]、Th17[10]、γδT[11]等免疫細(xì)胞的增殖分化，高效介導(dǎo)負(fù)向免疫調(diào)控，對(duì)機(jī)體抗感染、組織修復(fù)及免疫應(yīng)答發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)效用。在嚴(yán)重感染及炎癥狀態(tài)下，大量上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞壞死造成IL-33 釋放量顯著升高，可引起繼發(fā)性組織損害及免疫紊亂[12]。本研究結(jié)果顯示，CLP 術(shù)后24 h即可見(jiàn)小鼠脾臟組織中IL-33 蛋白水平明顯升高，并持續(xù)維持高水平至傷后72 h，可能與腹腔感染后膿毒癥的病理生理反應(yīng)相關(guān)。據(jù)報(bào)道，IL-33 作為一個(gè)多功能蛋白分子可發(fā)揮抗炎作用，通過(guò)增強(qiáng)感染病灶的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，增強(qiáng)細(xì)菌吞噬能力，有利于提高膿毒癥小鼠存活率[13-14]。但另有資料提示，膿毒癥狀態(tài)下IL-33 能激活Ⅱ型固有淋巴樣細(xì)胞，促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞的極化，通過(guò)IL-10 增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞群的擴(kuò)增，進(jìn)而誘導(dǎo)膿毒癥免疫抑 制[12]。本研究利用重組IL-33 蛋白刺激體外培養(yǎng)的正常小鼠脾臟DC，發(fā)現(xiàn)一定刺激劑量的IL-33 可致DC 成熟分化障礙，膿毒癥小鼠脾組織高水平IL-33可能是引發(fā)脾臟DC 功能抑制的重要因素之一。

業(yè)已明確，ST2 是IL-33 唯一確定的受體[15]，分為兩種形式：一種為膜受體，其胞外區(qū)與IL-33結(jié)合后啟動(dòng)下游信號(hào)分子的激活以調(diào)控細(xì)胞功能分化；另一種為可溶性因子（sST2），缺乏跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，在循環(huán)系統(tǒng)充當(dāng)IL-33 的誘餌受體，能與膜結(jié)合ST2 受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-33 而拮抗其生物學(xué)功能，阻止IL-33 的全身效應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CLP 小鼠術(shù)后1 h 給予sST2 干預(yù)（每只10 μg），可有效改善術(shù)后1 ～3 d 小鼠存活率。于傷后72 h 檢測(cè)可見(jiàn)脾臟DC 表面分子標(biāo)志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)水平均呈顯著上調(diào)，提示拮抗IL-33 可激活DC 免疫功能狀態(tài)，有效逆轉(zhuǎn)了膿毒癥小鼠脾臟DC 功能抑制狀態(tài)，對(duì)膿毒癥小鼠明確發(fā)揮了保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，CLP 術(shù)后脾臟組織IL-33 蛋白水平顯著升高，對(duì)DC 功能具有直接負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)；給予sST2 干預(yù)以拮抗IL-33生物學(xué)作用可明顯改善膿毒癥狀態(tài)下DC 的功能狀態(tài)?？梢?jiàn)，IL-33 可直接誘導(dǎo)DC 成熟分化障礙，是誘導(dǎo)膿毒癥后機(jī)體免疫功能紊亂的重要因素之一，針對(duì)IL-33 干預(yù)可能為膿毒癥防治提供新思路。