周華飛，楊紅福，陳宏州，束兆林，姚克兵，莊義慶

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400)

【研究意義】水稻惡苗病又名水稻徒長(zhǎng)病，是亞洲、非洲和北美洲一種常見(jiàn)的水稻病害[1]。近些年由于旱育秧技術(shù)和粳稻品種的加速推廣，水稻惡苗病菌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。【前人研究進(jìn)展】水稻惡苗病菌可造成水稻產(chǎn)量上10 %～20 %的損失，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50 %，同時(shí)導(dǎo)致谷粒變褐等稻米品質(zhì)下降[2]。1998年浙江永嘉惡苗病大面積爆發(fā)，最終統(tǒng)計(jì)面積約6500 hm2，損失最高達(dá)到產(chǎn)量的15 %。2005年黑龍江惡苗病暴發(fā)成災(zāi)導(dǎo)致農(nóng)戶直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)15萬(wàn)元。近些年來(lái)江蘇省受該病的影響也在加大，2012年江蘇省揚(yáng)州市水稻田部分田塊惡苗病發(fā)病率達(dá)到80 %，嚴(yán)重威脅水稻產(chǎn)量的安全[3]。在國(guó)外以水稻為主的糧食產(chǎn)區(qū)，水稻惡苗病帶來(lái)的威脅同樣與日俱增。2002年加利福尼亞統(tǒng)計(jì)水稻惡苗病的發(fā)病率達(dá)到80 %，造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)到30 %[4]。水稻惡苗病在韓國(guó)的水稻產(chǎn)區(qū)同樣造成了嚴(yán)重的損失[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前水稻惡苗病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，常用藥劑為咪鮮胺，主要通過(guò)作用于麥角甾醇生物合成途徑來(lái)達(dá)到防治該病的目的[6]。近幾年咪鮮胺的田間藥效逐年下降，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺已產(chǎn)生一定的抗藥性，江蘇部分地區(qū)的抗藥性已經(jīng)達(dá)到很高的水平[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)于近些年水稻惡苗病菌抗性的產(chǎn)生問(wèn)題，本研究采集和分離鎮(zhèn)江地區(qū)98株水稻惡苗病菌，進(jìn)行種屬鑒定，測(cè)定其對(duì)咪鮮胺的EC50值，檢測(cè)靶標(biāo)位點(diǎn)cyp51A位點(diǎn)的突變情況，旨在為延緩和改良抗性產(chǎn)生提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和菌株

97 %咪鮮胺原藥為江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室提供，使用甲醇配成2.0×103μg·mL-1母液待用。

供試的水稻惡苗病菌株采集于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地及周圍水稻產(chǎn)區(qū)，種植水稻品種主要為武運(yùn)粳21號(hào)、運(yùn)粳23號(hào)和運(yùn)粳24號(hào)，鎮(zhèn)稻18號(hào)等等，種植區(qū)常年使用咪鮮胺及其復(fù)配制劑來(lái)防治水稻惡苗病[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻惡苗病菌的分離鑒定 將采自于惡苗病發(fā)病田塊的晚期水稻植株接種于固體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH 7.0)[9]上，28 ℃條件下培養(yǎng)直至菌絲出現(xiàn)，進(jìn)行單孢分離，將獲得的菌株編號(hào)保存。將分離的單孢水稻惡苗菌株接種于50 mL液體PDA培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，過(guò)濾獲取菌絲，烘干菌絲。使用真菌DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取上述水稻惡苗病菌總DNA，以真菌ITS通用引物(ITS1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4-5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[10-13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為550 bp。總反應(yīng)體系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；Taq酶，1 μl；ITS，各1 μl；ddH2O，36 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 循環(huán)；72 ℃，10 min；10 ℃ 程序終止。PCR產(chǎn)物片段大小約為550 bp，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)條帶后，送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列經(jīng)NCBI-BLAST在線比對(duì)分析，使用MEGA 4系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)，確定上述水稻惡苗病菌的種屬關(guān)系及優(yōu)勢(shì)種群。

1.2.2 水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的EC50測(cè)定 以水稻惡苗病菌菌絲的生長(zhǎng)速率為依據(jù)的菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定[14-15]。咪鮮胺原藥濃度梯度設(shè)置為0.001、0.01、0.1、1和10 μg·mL-1，不添加咪鮮胺藥劑的PDA平板作為空白對(duì)照CK。在每個(gè)平板中央處接種直徑為8 mm的水稻惡苗病菌菌碟，在28 ℃條件下培養(yǎng)直至CK處理平板水稻惡苗病菌菌絲鋪滿整個(gè)平板為止。采用十字交叉法測(cè)量平板中菌落直徑，根據(jù)下列公式計(jì)算咪鮮胺對(duì)水稻惡苗病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率和EC50值。抑制率={(對(duì)照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/(對(duì)照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)}×100 %[16]。采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別計(jì)算藥劑對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)抑制的EC50值。

根據(jù)陳夕軍等[7]確認(rèn)的江蘇13個(gè)地區(qū)的水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性基線EC50為(0.00075±0.00003)μg·mL-1來(lái)確定江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺抗性倍數(shù)(EC50/敏感性基線)，分為低抗(5～10倍)、中抗(10～100倍)和高抗水平(100倍以上)。

1.2.3 水稻惡苗病菌抗咪鮮胺脫甲基酶cyp51A突變位點(diǎn)檢測(cè) 以水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺EC50大小為依據(jù)篩選出抗性和敏感最強(qiáng)的各2株菌株。接種上述4株水稻惡苗病菌于50 mL液體PDA培養(yǎng)基中，28 ℃條件下150 r/min搖培5～7 d，過(guò)濾收集菌絲，采用CTAB法提取4株病原菌的全基因組DNA。由NCBI檢索獲取水稻惡苗病菌cyp51A序列F.fujikuroiB14為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物cyp51AF(5’-TGTTTCCACTCCTCTACTAC-3’)和cyp51AR(5’-AAGCCTTCCTG CGTTGCC-3’)，PCR擴(kuò)增大小約為1500 bp的cyp51A片段?？偡磻?yīng)體系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；高保真Taq酶，1 μl；cyp51AF/R各1 μl；ddH2O，36 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，2 min，35 循環(huán)；72 ℃，10 min；10 ℃，程序終止。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)凝膠電泳確認(rèn)條帶，切膠回收純化片段送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列使用BioEdit軟件比對(duì)差異堿基，確認(rèn)差異位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻惡苗病菌的分離

江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)采集的98株水稻惡苗病菌經(jīng)實(shí)驗(yàn)室單孢分離和純化培養(yǎng)，以其菌絲生長(zhǎng)形態(tài)等表型特征，初步判斷全部成功分離上述98株水稻惡苗病菌。

2.2 水稻惡苗病菌的ITS鑒定

分離得到的98株水稻惡苗病菌菌絲DNA經(jīng)ITS序列擴(kuò)增得到的片段大小約為550 bp，測(cè)序堿基序列在NCBI-Blast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)同源度高的序列，使用系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析確認(rèn)98株全部是水稻惡苗病菌，如表1所示，其中藤倉(cāng)鐮刀菌[17](Gibberellafujikuroi)90株，層出鐮刀菌[18](Fusariumproliferatum)6株，輪枝鐮刀菌[19](Fusariumverticillioides)1株，新知鐮刀菌[20-21](Fusariumandiyazi)1株。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析可知，江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌優(yōu)勢(shì)種群為藤倉(cāng)鐮刀菌，占比為91.8 %，還出現(xiàn)了近些年才被鑒定的新種新知鐮刀菌1株。

表1 98株水稻惡苗病菌種屬鑒定結(jié)果

2.3 水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性分析

通過(guò)EC50鑒定結(jié)果可知，江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺抗性水平在0.011～0.175 μg·mL-1。依據(jù)抗性倍數(shù)劃分結(jié)果顯示全部是抗性菌株，抗性菌株中高抗菌株占77.6 %，中抗菌株占22.4 %，高抗菌株成為江蘇鎮(zhèn)江惡苗病菌中的優(yōu)勢(shì)種群(表2)。

2.4 水稻惡苗病菌抗性位點(diǎn)cyp51A的PCR檢測(cè)

cyp51A擴(kuò)增產(chǎn)物大約為1500 bp，測(cè)序后使用BioEdit軟件分析比對(duì)之后，比對(duì)結(jié)果如圖1所示。對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生顯著抗性菌株1、2與無(wú)抗性產(chǎn)生的敏感菌株3、4在咪鮮胺作用靶標(biāo)位點(diǎn)cyp51A序列完全一致，說(shuō)明水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生明顯抗性不是由于靶標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生的點(diǎn)突變導(dǎo)致，可能是由于其他相關(guān)位點(diǎn)的點(diǎn)突變或轉(zhuǎn)錄過(guò)量表達(dá)等非核酸突變類型。

3 討 論

近年來(lái)，水稻惡苗病逐漸成為水稻生產(chǎn)的主要真菌病害之一，世界上水稻主產(chǎn)區(qū)包括我國(guó)的江蘇和安徽等地發(fā)生呈現(xiàn)加重趨勢(shì)，造成稻米產(chǎn)量10 %～20 %的損失。隨著稻田旱育秧技術(shù)的推廣，改善了苗床的透氣性，為水稻惡苗病菌繁殖提供有力的條件，加重該病害的發(fā)生。此外，該病害可以還可以依附于水稻種表進(jìn)行傳代，藥劑浸種處理不徹底將再次加重病害的傳播。目前防治該病害除了依靠品種抗性之外，以多菌靈和咪鮮胺為主的化學(xué)農(nóng)藥成為最主要的手段[23]。水稻惡苗病菌對(duì)多菌靈的抗性十分嚴(yán)重，藥效十分差勁。近年來(lái)，抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌逐漸被發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺防效同樣呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，調(diào)查水稻產(chǎn)區(qū)水稻惡苗病菌對(duì)咪酰胺的抗性水平，分析抗性產(chǎn)生的原因，為抗性改良和研發(fā)新型防治水稻惡苗病菌藥劑提供理論支持，保證稻米產(chǎn)量及安全。

表2江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺抗性調(diào)查統(tǒng)計(jì)

Table 2 Survey and statistics on the resistance to prochloraz inFusariummoniliforein Zhenjiang, Jiangsu

抗性等級(jí)菌株總數(shù)抗性菌株數(shù)抗性占比(%)高抗987677.6中抗982222.4低抗9800

本研究從江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)分離得到98株水稻惡苗病菌，ITS序列[24-25]系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)確認(rèn)全部屬于水稻惡苗病菌，主要優(yōu)勢(shì)種群為有性態(tài)的藤倉(cāng)鐮刀菌，還存在少量的層出鐮刀菌與新發(fā)現(xiàn)的新種新知鐮刀菌等，說(shuō)明江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌種群資源較為豐富，優(yōu)勢(shì)致病種群明顯，與鄭睿等[22]報(bào)道一致。本研究測(cè)定上述98株水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的抗性水平，EC50結(jié)果顯示江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌抗性比例為100 %，抗性菌株中高抗菌株占比77.6 %，說(shuō)明水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺已產(chǎn)生大規(guī)模抗性，且抗性嚴(yán)重，咪鮮胺及其復(fù)配藥劑藥效才呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)。鄭睿等[22]報(bào)道江蘇常州地區(qū)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺EC50平均值達(dá)到0.253 μg·mL-1，顯著高于江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)的抗性水平，說(shuō)明江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)咪鮮胺抗性相比其他地區(qū)較低，但長(zhǎng)期單一使用咪鮮胺及其復(fù)配藥劑防治水稻惡苗病，定向篩選水稻惡苗病菌抗藥性，依舊會(huì)導(dǎo)致抗藥性急劇加重，我們需要研究抗性產(chǎn)生的原因，延緩抗性產(chǎn)生，或?yàn)殚_(kāi)發(fā)新型藥劑提供依據(jù)。

咪鮮胺類藥劑抑制水稻惡苗病菌等真菌主要途徑是抑制麥角甾醇生物合成路徑中必不可少的羊毛甾醇14-α去甲基酶(P45014DM，由cyp51A負(fù)責(zé)合成)[26-28]，該酶主要功能是催化羊毛甾醇的14-α位甲基的剪切，是常用的選擇性抗真菌藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)位點(diǎn)。趙志華和張錫明等[6,29-30]研究結(jié)果顯示水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生抗性機(jī)制與麥角甾醇的合成機(jī)制有關(guān)，其次是菌體對(duì)藥劑的排泄作用導(dǎo)致藥劑流失而產(chǎn)生抗藥性，排泄機(jī)制可能與cyp51A的過(guò)量表達(dá)有關(guān)，與cyp51A基因的核酸序列無(wú)關(guān)。本研究分析了對(duì)咪鮮胺最敏感和抗性最嚴(yán)重的各2株水稻惡苗病菌株的cyp51A位點(diǎn)突變情況，結(jié)果顯示上述4株菌株的cyp51A位點(diǎn)均無(wú)明顯的點(diǎn)突變或其他類型突變，證明cyp51A位點(diǎn)不是導(dǎo)致水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生抗性的原因。

圖1 2株抗性最高菌株與2株最敏感菌株cyp51A位點(diǎn)序列比對(duì)分析Fig.1 Alignment analysis of two highest resistant strains and two most sensitive strains of cyp51A

4 結(jié) 論

江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌以藤倉(cāng)鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)種群，對(duì)咪鮮胺已產(chǎn)生較高抗藥性，水稻惡苗病菌抗咪鮮胺機(jī)制非cyp51A點(diǎn)突變導(dǎo)致，可能與麥角甾醇合成途徑有關(guān)，也可能是菌體內(nèi)cyp51A的mRNA過(guò)表達(dá)和直接排泄藥劑來(lái)達(dá)到對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生抗性的目的。