張建明，田 甜，姜 偉

(1.中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所, 湖北 宜昌 443100;2.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室, 湖北 宜昌 443100)

【研究意義】長薄鰍(Leptobotiaelongate，Bleeker)，又稱薄鰍、花鰍，屬鰍科(Cobitidae)、沙鰍亞科(Botiinae)、薄鰍屬(Leptobotia)，系長江珍稀特有魚類，自1998年起正式列入中國瀕危動物紅皮書[1]。近年來，受過度捕撈、環(huán)境污染等人為因素的影響，長薄鰍的棲息環(huán)境受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致其數(shù)量越來越少，種群結(jié)構(gòu)日益發(fā)生變化，親魚數(shù)量不足，個體呈現(xiàn)小齡化趨勢，長薄鰍已達三級急切保護程度[2]。國內(nèi)進行了有關(guān)長薄鰍生物學(xué)特征、苗種培育、生長發(fā)育、血液學(xué)、急性毒性試驗等[3-7]方面的研究?！厩叭搜芯窟M展】魚體麻醉能有效抑制魚類在操作中的應(yīng)激反應(yīng)，對魚類起到保護作用。不同類型的操作需要不同濃度的麻醉劑進行麻醉，以期達到適宜于操作的目的，同時最大程度降低對魚體的傷害，如長途運輸、魚體標(biāo)記、生物學(xué)性狀觀察測量等操作需要區(qū)別對待，針對不同類型的操作，進行不同程度的麻醉。丁香酚(Eugenol)又稱丁香油、丁香油酚，是一種油狀的有類似于丁香香味的天然化合物，廣泛存在于丁香油、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中，對魚類有強烈的麻醉作用。丁香酚已被智利、新西蘭、澳大利亞等多國認(rèn)定為沒有殘留期的合法水產(chǎn)麻醉劑，被廣泛用于魚類的麻醉[8]?！颈狙芯壳腥朦c】在魚類麻醉研究方面已經(jīng)對中華鱘(Acipensersinensis)、斑馬魚(Daniorerio)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、羅非魚(Oreochromisspp.)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多種魚類開展了相關(guān)麻醉研究工作[9-12]，但丁香酚對長薄鰍的麻醉研究尚未見相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為此，本試驗開展了丁香酚對長薄鰍幼魚麻醉效果的研究，旨在為丁香酚在長薄鰍幼魚的長途運輸、標(biāo)記放流等人為操作方面提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚為中國長江三峽集團公司中華鱘研究所云南烏東德水電站魚類增殖放流站人工培育的長薄鰍幼魚。挑選體格健康、行動敏捷、無病無傷、規(guī)格基本一致的幼魚用于試驗，試驗魚規(guī)格為平均體長(5.57±0.29)cm，平均體質(zhì)量(1.95±0.24)g，試驗前在圓形暫養(yǎng)池(直徑3 m，水深0.7 m)中暫養(yǎng)5 d，試驗開始前2 d及試驗期間不投喂。

試驗用丁香酚由上海麥克林生化科技有限公司提供，含量99 %。使用前按丁香酚與無水乙醇1∶9比例配制溶液。

1.2 試驗條件

試驗在塑料盆內(nèi)進行，試驗用水為經(jīng)過曝氣和靜止沉淀后的金沙江水，水溫(22±1)℃，溶氧保持在6.0 mg/L以上。試驗期間保持試驗場所安靜、減少外界干擾對魚類造成的影響。

1.3 試驗方法

1.3.1 長薄鰍幼魚麻醉階段和復(fù)蘇過程的分期觀察 選取5尾長薄鰍幼魚置于60 mg/L的丁香酚麻醉液中進行預(yù)實驗，觀察魚體麻醉階段和復(fù)蘇過程中的行為變化，記錄各個麻醉階段和復(fù)蘇過程中的行為變化特征。根據(jù)長薄鰍幼魚的試驗觀察結(jié)果，并參考郭豐紅及劉長琳等[13-14]的分級標(biāo)準(zhǔn)，將長薄鰍幼魚麻醉程度劃分為Ⅰ～Ⅶ期(各階段分期名稱及行為特征詳見表1)，復(fù)蘇過程劃分為Ⅰ～Ⅳ期，各階段分期名稱及行為特征詳見表2。

1.3.2 不同濃度丁香酚麻醉劑對長薄鰍幼魚的麻醉效果 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計6個丁香酚濃度梯度，分別為20、40、60、80、100、120 mg/L，每個濃度梯度3個重復(fù)。每組試驗選取10尾長薄鰍幼魚，試驗過程中記錄長薄鰍幼魚的麻醉時間、復(fù)蘇時間、復(fù)蘇率、72 h存活率等指標(biāo)。麻醉所需時間是指魚被放進麻醉劑溶液開始到魚體側(cè)翻的時間，復(fù)蘇所需時間是指麻醉魚放入清水中開始至魚的行為完全恢復(fù)正常狀態(tài)所需的時間。

表1 長薄鰍幼魚麻醉程度分期及行為特征

表2 長薄鰍幼魚復(fù)蘇過程分期及行為特征

1.3.3 不同濃度丁香酚麻醉劑對長薄鰍幼魚呼吸頻率的影響 試驗設(shè)置20、40、60、80、100、120 mg/L等6個濃度處理組，每組10尾長薄鰍幼魚。呼吸頻率是指1 min內(nèi)魚體的呼吸次數(shù)，1次呼吸是以魚體鰓蓋一張一合為準(zhǔn)，統(tǒng)計連續(xù)呼吸30 s時各處理組長薄鰍幼魚的呼吸次數(shù)，然后換算為1 min內(nèi)呼吸次數(shù)即為魚體對應(yīng)的呼吸頻率。每個處理組長薄鰍幼魚的呼吸頻率取10尾長薄鰍幼魚的平均值。

1.3.4 在空氣中暴露時間長短對深度麻醉長薄鰍幼魚復(fù)蘇的影響 為研究麻醉后離水操作的可行性，選用60 mg/L的丁香酚濃度對長薄鰍幼魚進行麻醉，待魚體麻醉后，將試驗魚置于空氣中進行暴露，暴露時間分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 min，之后轉(zhuǎn)入清水進行復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇所需時間、復(fù)蘇率及72 h存活率，每組10尾試驗魚。

1.3.5 模擬長途運輸試驗 選取4種模式對長薄鰍幼魚進行模擬長途運輸試驗。模式1：長薄鰍幼魚直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h；模式2：長薄鰍幼魚直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h；模式3：長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h；模式4：長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h。試驗期間各組微充氣保證溶氧，浸泡10 h后放入清水進行復(fù)蘇，觀察統(tǒng)計各組的鎮(zhèn)靜效果、復(fù)蘇率及成活率，每組10尾試驗魚。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel軟件進行統(tǒng)計，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度丁香酚麻醉劑對長薄鰍幼魚的麻醉效果

從表3中可知，20～120 mg/L質(zhì)量濃度的丁香酚均能使長薄鰍幼魚進入第Ⅴ期(麻醉期)，并且麻醉后及時進行復(fù)蘇的復(fù)蘇率均為100 %，復(fù)蘇后72 h內(nèi)的存活率也均為100 %；同時，從試驗結(jié)果的多重比較得知，20、40 mg/L試驗組的入麻時間與其它各組存在顯著差異(P<0.05)；60與80 mg/L試驗組差異不顯著(P>0.05)，與其它各組差異顯著(P<0.05)；80 mg/L試驗組與60、100 mg/L試驗組差異不顯著(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)；100 mg/L試驗組與80、120 mg/L試驗組差異不顯著(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)；120 mg/L試驗組與100 mg/L試驗組差異不顯著(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)。不同組別之間復(fù)蘇所用時間均存在顯著差異(P<0.05)。

丁香酚濃度在20～120 mg/L范圍內(nèi)，平均入麻時間隨著丁香酚麻醉劑濃度的增加而減少，兩者呈負(fù)相關(guān)(圖1)，通過回歸計算得知，丁香酚濃度與平均入麻時間的相關(guān)關(guān)系為：y=232x-1.328，R2=0.9831；式中y為入麻所需時間(s)，x為丁香酚濃度(mg/L)。平均復(fù)蘇時間隨著丁香酚濃度的增加而增加，復(fù)蘇時間與丁香酚濃度呈正相關(guān)(圖1)，通過回歸計算得知，丁香酚濃度與平均復(fù)蘇時間的相關(guān)關(guān)系為：y=61.297x+95.027，R2=0.9802；式中y為平均復(fù)蘇時間(s)，x為丁香酚濃度(mg/L)。隨著麻醉劑量的增大，復(fù)蘇所需的時間也在增加，在高劑量(≥80 mg/L)麻醉劑濃度下，復(fù)蘇時間超過了Marking等[15]認(rèn)為的理想麻醉有效濃度，對魚的影響較大。

圖1 不同濃度丁香酚對長薄鰍幼魚入麻時間和復(fù)蘇時間的影響Fig.1 Effects of different concentrations of eugenol on anesthesia time and recovery time of juvenile elongateloach

處理濃度(mg·L-1)Concentration麻醉所用時間(s)Anesthesia time復(fù)蘇所用時間(s)Recovery time范圍Range均值Mean范圍Range均值Mean復(fù)蘇率( %)Recovery rate72 h存活率( %)Survival rate of 72 hours20239～278257.20±16.32a167～181172.20±5.93a1001004063～8776.20±10.73b198～227212.20±11.26b1001006043～5352.40±7.13c256～291274.40±13.99c1001008031～5039.60±6.91cd307～351326.00±17.78d10010010025～3930.20±5.54de362～410385.80±17.68e10010012013～3020.40±6.47e433～534486.80±17.18f100100

注：同列數(shù)據(jù)中具相同小寫肩標(biāo)字母的表示組間無顯著差異，具不同小寫肩標(biāo)字母的表示組間差異顯著(LSD多重比較，P<0.05)。

Note: There was no significant difference between the groups in the same column with the same lowercase and shoulder acronym, with different lowercase and shoulder acronyms indicating significant differences between groups (LSD multiple comparisons,P<0.05).

2.2 不同濃度丁香酚麻醉劑對長薄鰍幼魚呼吸頻率的影響

如圖2所示，當(dāng)試驗魚放入麻醉液中后，各試驗組長薄鰍幼魚呼吸頻率均在短時間呈現(xiàn)出上升趨勢，之后在整個麻醉過程中呈現(xiàn)下降趨勢；對照組中長薄鰍幼魚的呼吸頻率在整個觀察過程中沒有出現(xiàn)較大程度的變化。20、40 mg/L試驗組長薄鰍幼魚的呼吸頻率在經(jīng)歷了先升后降的過程之后，呼吸頻率趨于穩(wěn)定，在一定的區(qū)間內(nèi)小幅度的變化；60～120 mg/L范圍內(nèi)各試驗組中的長薄鰍幼魚呼吸頻率經(jīng)歷小幅上升之后，均呈現(xiàn)直線下降趨勢，并進入第Ⅶ期(休克期)。

2.3 在空氣中暴露時間長短對深度麻醉長薄鰍幼魚復(fù)蘇的影響

由表4可知，以60 mg/L丁香酚將長薄鰍幼魚麻醉后再在空氣中進行暴露，隨著暴露時間的增加，復(fù)蘇所用的時間減少，其中暴露2、4、6 min試驗組復(fù)蘇用時與其它各組存在顯著性差異(P<0.05)，而暴露8～26 min試驗組之間的復(fù)蘇用時差異性不顯著(P>0.05)。暴露時間在2～24 min范圍內(nèi)的復(fù)蘇率和72 h存活率均為100 %，當(dāng)時間增加至26 min時，復(fù)蘇率降低到了70 %，72 h存活率僅為40 %。

圖2 不同濃度丁香酚麻醉劑對長薄鰍幼魚呼吸頻率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of eugenol on respiration rate of juvenile elongateloach

2.4 模擬長途運輸試驗

由表5可知，長薄鰍幼魚直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h(模式1)，試驗魚始終處于鎮(zhèn)靜期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %；長薄鰍幼魚直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h(模式2)，試驗魚始終處于麻醉期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %；長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h(模式3)，試驗魚能夠調(diào)整身體保持正常狀態(tài)，可以從麻醉期轉(zhuǎn)入鎮(zhèn)靜期，之后始終保持在鎮(zhèn)靜期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %；長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h(模式4)，試驗魚未從麻醉期轉(zhuǎn)入鎮(zhèn)靜期，反而麻醉程度進一步加深，之后進入休克期，復(fù)蘇率和成活率均為0。

3 討 論

3.1 丁香酚對長薄鰍幼魚麻醉的有效質(zhì)量濃度

魚體麻醉后要需經(jīng)歷觸覺喪失期、興奮期和麻醉期這3個時期[16]。在水溫(22±1)℃條件下，20～120 mg/L的丁香酚麻醉液均能使長薄鰍幼魚經(jīng)歷上述3個階段，且麻醉濃度與與平均入麻時間呈負(fù)相關(guān)，與平均復(fù)蘇時間呈正相關(guān)。這與丁香酚對蘇氏圓腹魚芒(Pangasiussutchi)[17]和日本黃姑魚(Nibeajaponica)[18]麻醉效果的研究結(jié)果相一致。本試驗的研究結(jié)果表明20～120 mg/L的丁香酚麻醉液均能使長薄鰍幼魚進入麻醉階段，并可以完全復(fù)蘇，Marking等[15]認(rèn)為3 min內(nèi)能夠麻醉、并且5 min內(nèi)能夠蘇醒是理想麻醉劑的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，按照此標(biāo)準(zhǔn)，40～60 mg/L的丁香酚麻醉液是長薄鰍幼魚的理想麻醉濃度。此外，麻醉劑的麻醉效果還與魚體規(guī)格、水溫、水質(zhì)等因素有關(guān)[19-20]，相關(guān)的麻醉效果有待進一步研究闡明。

表4 空氣中暴露時間長短對深度麻醉長薄鰍幼魚復(fù)蘇的影響

注：表中所示72 h存活率指72 h后存活的試驗魚數(shù)量占該組試驗魚總數(shù)的百分比。同列數(shù)據(jù)中具相同小寫字母的表示組間無顯著差異，具不同小寫字母的表示組間差異顯著(LSD多重比較，P<0.05)。

Note: The 72 hours survival rate showed in the table refers to the percentage of test fish surviving after 72 hours as a percentage of the total number of test fish in the group. There was no significant difference between the groups in the same column with the same lowercase and shoulder acronym, with different lowercase and shoulder acronyms indicating significant differences between groups (LSD multiple comparisons,P<0.05).

表5 不同運輸模式對長薄鰍幼魚的影響

3.2 丁香酚對長薄鰍幼魚呼吸頻率的影響

呼吸頻率因麻醉程度不同而呈現(xiàn)變化。麻醉初期藥物首先作用于血液循環(huán)系統(tǒng)，呼吸頻率稍有變化，隨著麻醉時間的延長，藥物進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致行為能力和呼吸頻率均出現(xiàn)明顯變化。關(guān)于麻醉劑對魚體呼吸頻率的影響，一般認(rèn)為魚體呼吸頻率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，例如鱖(Sinipercachuatsi)[13]、圓斑星鰈(Veraspervariegates)[19]、鯉(Cyprinuscarpio)[21]等。本試驗研究結(jié)果與其相似，各濃度組長薄鰍幼魚呼吸頻率均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且隨著麻醉劑質(zhì)量濃度的升高，呼吸頻率下降越來越快。在丁香酚濃度≤40 mg/L時，長薄鰍呼吸頻率下降呈漸變趨勢，且后期趨于穩(wěn)定；在丁香酚濃度≥60 mg/L時，呼吸頻率基本上呈現(xiàn)直線下降趨勢，且進入休克期。可見麻醉劑劑量對魚體呼吸頻率具有較大影響，這與丁香酚麻醉許氏平鮋(Sebastesschlegelii)[22]、黃臘鲹(Trachinotusblochii)[23]等研究結(jié)果相一致。

3.3 空氣中暴露時間對長薄鰍幼魚復(fù)蘇的影響

研究在空氣中暴露時間長短對深度麻醉魚體復(fù)蘇的影響，對于活體離水操作具有一定的指導(dǎo)意義[16]。以60 mg/L丁香酚將長薄鰍幼魚麻醉后再在空氣中進行暴露，隨著暴露時間的增加，復(fù)蘇所用的時間減少，這可能是因為在暴露過程中長薄鰍幼魚在不斷的對丁香酚麻醉劑進行代謝導(dǎo)致進入體內(nèi)的麻醉劑濃度降低造成的，這與丁香酚對蘇氏圓腹魚芒(Pangasiussutchi)[17]和鯽魚(Carassiusauratus)[20]的麻醉研究結(jié)果相似。同時，試驗研究表明暴露2～24 min試驗各組的復(fù)蘇率和72 h存活率均為100 %，當(dāng)暴露時間增加至26 min時，復(fù)蘇率降低到了70 %，72 h存活率僅為40 %。因此，麻醉后對長薄鰍幼魚進行稱重、測量、體外標(biāo)記等離水操作時，需將操作時間控制在26 min以內(nèi)，以確保長薄鰍幼魚的安全。

3.4 丁香酚在長薄鰍幼魚長途運輸中的安全性

活魚運輸中使用麻醉劑既可以提高成活率又可以有效的增加運輸距離[23]。麻醉劑的麻醉劑量對活魚運輸具有重要意義，過高或過低均無法滿足運輸需求。為了進一步驗證丁香酚對長薄鰍幼魚長途運輸?shù)陌踩?，設(shè)計4種模擬長途運輸試驗，研究結(jié)果表明：長薄鰍幼魚直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h，試驗魚始終處于鎮(zhèn)靜期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %，這是由于10 mg/L丁香酚麻醉液不能使長薄鰍進入麻醉期，而是長期處于鎮(zhèn)靜期，既滿足了降低長薄鰍幼魚的代謝，又未產(chǎn)生傷害；長薄鰍幼魚直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h，試驗魚始終處于麻醉期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %，這種模式雖然復(fù)蘇率和成活率均為100 %，但在整個試驗過程中長薄鰍幼魚始終處在麻醉階段，這可能因長期處于麻醉期會對其內(nèi)臟器官、神經(jīng)系統(tǒng)造成一定的傷害；長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入10 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h，試驗魚能夠調(diào)整身體保持正常狀態(tài)，可以從麻醉期轉(zhuǎn)入鎮(zhèn)靜期，之后始終保持在鎮(zhèn)靜期，復(fù)蘇率和成活率均為100 %，這種模式下長薄鰍幼魚能夠從麻醉期轉(zhuǎn)入鎮(zhèn)靜期，可能是長薄鰍幼魚在10 mg/L丁香酚麻醉液中能夠通過代謝不斷的降低體內(nèi)的麻醉液濃度而未長時間的處于麻醉階段，對魚體影響較小，這種模式可以進一步的降低在運輸裝車、打包等環(huán)節(jié)的應(yīng)激反應(yīng)；長薄鰍幼魚經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即轉(zhuǎn)入20 mg/L丁香酚麻醉液中連續(xù)浸泡10 h，試驗魚沒有從麻醉期轉(zhuǎn)入鎮(zhèn)靜期，反而麻醉程度進一步加深，之后進入休克期，復(fù)蘇率和成活率均為0，這可能是長薄鰍幼魚在轉(zhuǎn)入20 mg/L丁香酚麻醉液中后，不能對體內(nèi)高濃度的麻醉劑進行有效代謝造成的。學(xué)者們研究認(rèn)為深度鎮(zhèn)靜期是最適宜的運輸時期[24-25]。建議采用10 mg/L丁香酚麻醉液和經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后立即轉(zhuǎn)入10 mg/L丁香酚麻醉液的運輸模式，對長薄鰍幼魚的影響較小，適合于長途運輸，可推廣至實踐應(yīng)用中。

4 結(jié) 論

40～60 mg/L的丁香酚麻醉液是長薄鰍幼魚的理想麻醉濃度；以60 mg/L丁香酚將長薄鰍幼魚麻醉后對其進行稱重、測量、體外標(biāo)記等離水操作時，需將操作時間控制在26 min以內(nèi)，以確保長薄鰍幼魚的安全；采用10 mg/L丁香酚麻醉液和經(jīng)60 mg/L的丁香酚麻醉后立即轉(zhuǎn)入10 mg/L丁香酚麻醉液的運輸模式，可使長薄鰍進入鎮(zhèn)靜期，且對試驗魚影響較小，推薦作為長薄鰍幼魚長途運輸模式。