李曉潔，姜俊，周瑞芳，刁愛芹，鄭濤，葉軍

(1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)與藥學(xué)教研室；2.泰州市人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇 泰州 225300)

短期內(nèi)患者體重快速下降是多種腫瘤共同的臨床表現(xiàn)之一，患者體重下降的可能原因是腫瘤細胞快速生長時需攝取體內(nèi)大量營養(yǎng)物質(zhì)，為其生理活動提供能量。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞主要通過糖酵解的方式供能，產(chǎn)熱量低，攝食供能低于機體所需熱量，導(dǎo)致機體正常細胞能量不足[1]，必須通過消耗自身組織以滿足生命活動能量需求。若3個月來漸進性消瘦，體重比原始體重(診斷時)下降≥7.5%，或IBM指標(biāo)<80%即診斷為惡病質(zhì)[2]。Solheim等[3]認(rèn)為惡病質(zhì)的異常代謝，引起免疫力下降，可能刺激腫瘤細胞的生長和增殖。因此預(yù)防和延緩惡病質(zhì)的發(fā)生對腫瘤治療有重要意義。惡病質(zhì)的發(fā)生機制目前尚不清楚。

唾液酸酶主要參與調(diào)解機體內(nèi)唾液酸的含量[4-5]，目前根據(jù)反應(yīng)底物和亞細胞定位分為四型[6-8]，其中第三型主要定位在質(zhì)膜[9]，因此命名為質(zhì)膜型唾液酸酶(human plasma membrane-associated sialidase，Neu3)。Neu3在多種腫瘤組織中高表達，如前列腺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、卵巢癌[12]、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤[13]等。

本研究建立前列腺癌原位腫瘤模型，觀察Neu3不同表達水平干預(yù)措施后，裸鼠攝食量、體重等的變化，通過體外實驗觀察Neu3不同表達水平對細胞活性、遷移能力的影響，探尋Neu3影響惡病質(zhì)的可能機制，研究成果有助于尋找延緩惡病質(zhì)發(fā)生、發(fā)展，改善患者生存質(zhì)量，延長生存期的藥物。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

移液器(JILSON公司)、低溫高速離心機、-80 ℃低溫冰箱、自動高壓蒸汽消毒器(SONY公司)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司)、電轉(zhuǎn)儀、YZ-875超凈工作臺、無菌動物飼養(yǎng)隔離器、電子天平。

1.2 主要試劑

IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(GBICO 美國)、胎牛血清(Hyclone公司)、MTT(SIGMA 美國)LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)試劑盒。

1.3 質(zhì)粒、菌種及細胞系

PC-3、LNCaP細胞均購于美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫，質(zhì)粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP購于上海吉凱化學(xué)公司，pGCsi-Neu3質(zhì)粒為作者研究生期間在吉林大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)實驗室構(gòu)建，干預(yù)效率大于50%，減毒沙門氏菌為吉林大學(xué)病理生理學(xué)實驗室所保存。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗

PC-3、LNCaP細胞按ATCC培養(yǎng)條件：用含有100 μg/mL青鏈霉素IMDM(Hyclone,USA) 、10%胎牛血清的培養(yǎng)液在37 ℃含5% CO2孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌PC-3細胞并傳代。轉(zhuǎn)染操作參照Lip2000說明，只加入轉(zhuǎn)染試劑實驗分組命名為Mock，轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒pGCsi-Scramble的實驗分組命名為pGCsi-Scramble，轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒實驗分組命名為pGCsi-Neu3，Mock和pGCsi-Scramble統(tǒng)稱為對照組。

1.5 MTT實驗

取對數(shù)生長期的PC-3、LNCaP細胞，按照轉(zhuǎn)染實驗分組，每組設(shè)有5個重復(fù)孔，MTT法測定各孔的OD值，間接衡量細胞增殖能力。

1.6 減毒沙門氏菌感受態(tài)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入目的基因及干涉效率檢測

在預(yù)冷后的電轉(zhuǎn)杯中加入1 μL質(zhì)粒和100 μL減毒沙門氏菌，在參數(shù)為：電壓600 V，單次電擊，電擊持續(xù)時間30 ms的條件下進行目的基因?qū)氩僮鳌；旌衔锏斡诤珹mp的LB平板 37 ℃培養(yǎng)16～20 h。選取單菌落，轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待OD600大約為0.4時保存菌液，并將其中一部分并送上海吉凱化學(xué)公司測序，檢測是否構(gòu)建成功。通過RT-PCR和Western Blotting兩種方法檢測在體內(nèi)是否可發(fā)揮體外類似的沉默效率。

1.7 人前列腺癌裸鼠腫瘤原位模型的建立及處理

將購置的6周左右BALB/C nu/nu雄性裸鼠飼養(yǎng)于大型恒溫?zé)o菌硬塑隔離器。按照每只小鼠注射100 μL細胞懸液，細胞懸液濃度為2.0×107/mL的參數(shù)進行腫瘤皮下模型的制備。當(dāng)皮下腫瘤生長至最大直徑為0.5 cm時，在無菌環(huán)境中分離皮下腫瘤，并割成2×2×2 mm3大小的瘤塊，為后續(xù)腫瘤原位模型做準(zhǔn)備[10]。將腫瘤原位模型術(shù)后狀態(tài)良好的小鼠隨機分組，每組6只。對照組(Mock)給予PBS，Attenuated Salmonella組(AS)給予減毒沙門氏菌，pGCsi-Scramble質(zhì)粒組(pGCsi-Scramble)給予攜帶pGCsi-Scramble質(zhì)粒的減毒沙門氏菌，pGCsi-Neu3質(zhì)粒組(pGCsi-Neu3)攜帶pGCsi-Neu3質(zhì)粒的減毒沙門氏菌。通過尾靜脈給藥的方式進行給藥。每兩周給予一次，共給兩次。在4、8、12、16等4的倍數(shù)的時間點檢測裸鼠的進食量、體重。每組老鼠的進食量=(初始投放食物量-檢測時間點實際食物量)/(天數(shù))。

1.8 ELASA 法測定裸鼠血清IL-6的水平

選用IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)試劑盒，測定過程參照試劑說明書完成。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包處理，應(yīng)用Excel作圖。用F檢驗首先進行方差分析，以q檢驗判斷差異顯著性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察pGCsi-Neu3質(zhì)粒對腫瘤細胞形態(tài)的影響

PC-3細胞轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒24 h后，細胞透光性降低，細胞變圓，偽足減少，產(chǎn)生大量漂浮細胞，對照組細胞呈現(xiàn)梭型，透亮度好，少見漂浮細胞，見圖1A。LNCaP細胞轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3細胞發(fā)生與PC-3細胞類似的形態(tài)學(xué)變化，見圖1B。

2.2 MTT檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)染后細胞增殖變化

PC-3細胞轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒后，在24 h、48 h、72 h等時間點檢測細胞數(shù)目，其結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒后細胞數(shù)目增長速度明顯減慢，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2A。LNCaP細胞轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒后獲得與PC-3細胞類似的趨勢，見圖2B。

2.3 劃痕實驗檢測細胞轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒細胞遷移能力的改變

轉(zhuǎn)染后分別在0 h、12 h、24 h拍照并測量劃痕寬度，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染12 h后，對照組(Mock)以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(pGCsi-Scramble)細胞出現(xiàn)明顯遷移，轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染pGCsi-Neu3質(zhì)粒組細胞遷移的距離與對照組(Mock)以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(pGCsi-Scramble)細胞遷移距離與相比差異明顯減小，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 裸鼠進食量的檢測

裸鼠進食量數(shù)據(jù)顯示Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組，裸鼠進食量逐漸減少，試驗結(jié)束時，與pGCsi-Neu3實驗組相比進食量差異明顯(P<0.05，P<0.01)。見圖4。

2.5 裸鼠體重的檢測

裸鼠體重數(shù)據(jù)顯示Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組裸鼠體重逐漸減輕。第20天起與pGCsi-Neu3實驗組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；試驗結(jié)束時，與pGCsi-Neu3實驗組相比體重差異明顯(P<0.01)，見圖5。

2.6 裸鼠腫瘤組織Neu的表達

取不同分組的腫瘤組織，通過RT-PCR和Western Blotting 檢測通過減毒沙門氏菌運載后，在體內(nèi)Neu3在RNA和蛋白水平的沉默效率。見圖6。

2.7 裸鼠血清IL-6的檢測結(jié)果

裸鼠血清IL-6檢測結(jié)果顯示：Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組IL-6水平分別為(121.76±34.25)pg/mL，(118.76±30.89)pg/mL，(116.76±32.46)pg/mL。pGCsi-Neu3組IL-6水平為(60.76±20.88)pg/mL，與Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組相比IL-6水平明顯下降。

3 討論

惡病質(zhì)主要表現(xiàn)為患者食欲差，進食量下降，體重非意愿性逐漸下降，外形呈現(xiàn)皮包骨頭。腫瘤末期大約有80%的病人會發(fā)生惡病質(zhì)[14-15]。很多腫瘤患者并非死于腫瘤本身，而是死于惡病質(zhì)[16-17]。研究數(shù)據(jù)表明：腫瘤患者體重下降30%，肌肉蛋白儲備下降75%，是預(yù)示生存率降低的獨立危險因素[18]。由于腫瘤細胞進行糖酵解進行供能，產(chǎn)熱量低，可能導(dǎo)致機體所需進食量與患者實際進食量差值變大，因此機體需要分解自身成分用于供能。本實驗下調(diào)Neu3表達，通過光鏡觀察到細胞透亮度降低，偽足數(shù)量減少。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)Neu3表達水平下降時細胞增殖能力下降；劃痕實驗證實細胞遷移能力下降。利用減速沙門氏菌作為運載體進行靶向治療。前列腺癌荷瘤小鼠Mock組、AS組和pGCsi-Scramble組小鼠在實驗過程中，體重不斷下降，攝食量減少，精神狀態(tài)較差，活動較少，逐步出現(xiàn)惡病質(zhì)征象，在實驗結(jié)束時脂肪層較薄，皮膚蒼白，背部可清晰的看到脊柱棘突。pGCsi-Neu3實驗組體重較對照組相比，精神狀態(tài)尚好，脂肪層相對正常，皮膚較紅潤，惡病質(zhì)征象不明顯。IL-6作為炎性刺激因子，在多種腫瘤中高表達，與惡病質(zhì)、晚期腫瘤階段和存活率相關(guān)[19-20]。本研究下調(diào)Neu3，IL-6表達下降。根據(jù)以上結(jié)果推測，惡病質(zhì)的發(fā)生可能與腫瘤細胞的數(shù)目相關(guān)。腫瘤細胞絕對數(shù)越大，攝食供能低于機體所需熱量差值越大。腫瘤細胞分布越廣，越容易從周圍細胞獲取能量。腫瘤的分布主要通過轉(zhuǎn)移實現(xiàn)。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移早期形成各種偽足，其中侵襲性偽足關(guān)注度最高[21]。細胞偽足是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要工具，其運動是一個主動耗能過程[22]。因此，下調(diào)Neu3延緩前列腺癌荷瘤小鼠惡病質(zhì)發(fā)病時間和疾病發(fā)生進展，其可能機制時抑制腫瘤細胞增殖和細胞遷移能力及IL-6的水平實現(xiàn)的。

總之，本研究表明Neu3可改善裸鼠的食欲，延緩惡病質(zhì)的發(fā)生，其具體分子機制將在下一步深入探討。