文/石有權(quán) 張進(jìn)紅

（1 河北省灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局；2 河北省唐山市畜牧工作站）

近年來，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)正經(jīng)歷著從單純的規(guī)模化、集約化生產(chǎn)方式向標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變，目前已成為資本、技術(shù)雙密集型行業(yè)。2015—2017年期間，唐山市每年的奶牛存欄量在40 萬(wàn)頭以上，居全省前列，是奶牛養(yǎng)殖大市。其中，存欄300 頭及以上規(guī)模的奶牛場(chǎng)（區(qū)）達(dá)到了300 多個(gè)，奶業(yè)一直是唐山市傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。但與奶牛養(yǎng)殖發(fā)達(dá)國(guó)家及國(guó)內(nèi)發(fā)達(dá)地區(qū)相比，唐山市奶牛飼養(yǎng)管理整體水平差距較大，尤其體現(xiàn)在奶牛早期妊娠診斷方面。

2015—2017 年河北省唐山地區(qū)開展奶牛早期妊娠診斷技術(shù)推廣，本項(xiàng)目所推廣的奶牛早期妊娠診斷方法，是通過檢測(cè)妊娠相關(guān)物質(zhì)——妊娠相關(guān)蛋白 （Pregnancy Associated Glycoprotein，PAGs），來判斷該牛是否懷孕的一種準(zhǔn)確、快速、操作便捷的檢測(cè)方法。該方法對(duì)妊娠第28天及以后的母牛血液中PAGs濃度進(jìn)行檢測(cè)和判讀，進(jìn)而判斷該母牛是否已經(jīng)妊娠，該技術(shù)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下七大方面：（1）配種后28 天準(zhǔn)確判定空懷牛只，及時(shí)做出繁殖管理決策；（2）空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率高，達(dá)到99.9%以上；（3）縮短空懷天數(shù)，降低飼料成本，提高繁殖率；（4）尾根靜脈采血檢測(cè)，對(duì)牛體傷害小，利于胚胎安全，不會(huì)由于早期觸摸胚胎發(fā)生胚胎損失；（5）可實(shí)現(xiàn)大批量檢測(cè)，不僅適用于小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，尤其適宜現(xiàn)代化大型規(guī)?；?chǎng)使用；（6）體外操作，大大降低了人畜共患病的感染幾率，降低牛只間交叉感染和疫病傳播的風(fēng)險(xiǎn)；（7）技術(shù)操作誤差小，減少繁殖人員的工作強(qiáng)度。

1 奶牛早期妊娠診斷技術(shù)要點(diǎn)

1.1 奶牛早期妊娠診斷的操作流程

1.1.1 樣品的采集

采集配種后28 天及以上天數(shù)的母牛血樣，分離血清，以備檢測(cè)。

1.1.2 試劑準(zhǔn)備

（1）在使用之前，所有的試劑必須恢復(fù)到18～26 ℃。

（2）應(yīng)通過輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混合均勻。（3）移液器和吸頭的準(zhǔn)備，確保每個(gè)樣本1 個(gè)吸頭。

（4）使用蒸餾水或去離子水對(duì)濃縮洗滌液進(jìn)行10 倍稀釋（每個(gè)反應(yīng)板條需10 mL濃縮洗滌液加入90 mL水中）。

1.1.3 檢測(cè)操作

（1）試劑及樣品的加入

在所有樣品和對(duì)照孔內(nèi)滴加1 滴樣品稀釋液，確保每個(gè)樣品1 個(gè)吸頭。用移液器、吸頭吸取陰性對(duì)照并分別加入2 個(gè)孔內(nèi)，吸取陽(yáng)性對(duì)照分別加入2 個(gè)孔內(nèi)，吸取樣品（血清）并加入適當(dāng)孔內(nèi)，輕彈微量反應(yīng)板，使其反應(yīng)板中的溶液混勻，蓋好蓋板，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min）。 孵育完成后，移除蓋板，快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，將板孔內(nèi)液體棄入廢液缸或水槽，用裝有洗滌溶液的洗瓶洗板3～5 次。

（2）檢測(cè)溶液加入

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2 滴檢測(cè)溶液，蓋好板蓋，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min），再次進(jìn)行洗板3～5 次。

（3）酶標(biāo)抗體加入

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2 滴酶標(biāo)抗體，蓋好板蓋，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min），再次進(jìn)行洗板3～5 次。

（4）底物液和終止液加入

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2 滴TMB底物溶液，室溫下孵育15 min（可以有誤差1 min），此步驟必須避光操作。后在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2 滴終止液終止反應(yīng)。注意：在加終止液時(shí)要按加入底物溶液的順序進(jìn)行滴加，輕彈微量反應(yīng)板將反應(yīng)板中的溶液混勻。

1.1.4 讀板及結(jié)果判定

動(dòng)物的妊娠狀態(tài)是由肉眼觀察孔內(nèi)顏色決定的，若與陽(yáng)性對(duì)照孔呈藍(lán)色的為陽(yáng)性，與陰性對(duì)照孔顏色相似為空懷，如樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認(rèn)為可疑/疑似，推薦妊娠復(fù)檢。

1.2 試劑盒及相關(guān)耗材的儲(chǔ)存

試劑儲(chǔ)存于2～8 ℃環(huán)境條件下。

1.3 檢測(cè)結(jié)果的判斷及相應(yīng)處理

1.3.1 為了保證試驗(yàn)的有效性，陽(yáng)性對(duì)照孔必須變藍(lán)。如果陽(yáng)性對(duì)照孔沒有變藍(lán)，試驗(yàn)結(jié)果是無(wú)效的，則需要根據(jù)說明書重新進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 對(duì)比樣品和陰性對(duì)照呈現(xiàn)顏色，如兩個(gè)孔的顏色難以用肉眼分辨，則被認(rèn)為可疑或疑似，建議重新采樣復(fù)檢。

1.3.3 檢測(cè)結(jié)果為陰性，則判定該母牛為空懷，但在對(duì)該母牛進(jìn)行下一步處理，尤其是同期發(fā)情處理前，應(yīng)足夠慎重，避免出現(xiàn)因本次處理而人為導(dǎo)致的妊娠母牛流產(chǎn)。

1.3.4 在奶牛妊娠早期，胚胎死亡是很常見的現(xiàn)象。而在胚胎死亡的早期，PAGs蛋白會(huì)在母牛體內(nèi)循環(huán)?？梢栽谝欢螘r(shí)間后重新采樣進(jìn)行妊娠復(fù)檢，也可采用其他妊娠檢測(cè)方法確認(rèn)。生產(chǎn)負(fù)責(zé)人應(yīng)與獸醫(yī)一起制定出適合于本場(chǎng)的繁殖管理程序。

1.4 其他注意事項(xiàng)

嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明操作，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作，為了得到較好的試驗(yàn)結(jié)果，還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）把所有的生物材料當(dāng)作潛在的傳染源來處理，在處理樣品時(shí)佩戴防護(hù)手套、穿防護(hù)服、戴防護(hù)眼鏡及防護(hù)面罩，用過的材料要無(wú)害化處理。（2）小心操作，防止試劑盒組分污染。（3）不要使用過期的試劑盒。

2 唐山地區(qū)奶牛早期妊娠診斷技術(shù)推廣應(yīng)用情況

2.1 開展奶牛養(yǎng)殖情況調(diào)查及結(jié)果分析

2015年1 月開展了全市奶牛養(yǎng)殖情況調(diào)查，包括各主要縣市區(qū)能繁母牛數(shù)、目前采用的妊娠診斷方法、妊娠診斷時(shí)間、平均空懷天數(shù)、配種期母牛日均采食量和飼料成本等情況。根據(jù)調(diào)查結(jié)果分析，本次共調(diào)研規(guī)模奶牛場(chǎng)225 個(gè)，其中，在妊娠診斷方法方面，217 個(gè)場(chǎng)采用直腸觸診（PPR）法，占比96.44%；8 個(gè)場(chǎng)采用或結(jié)合采用B超法，占比3.56%；沒有牛場(chǎng)采取利用早期孕檢試劑盒等產(chǎn)品的早期妊娠檢測(cè)方法。具體調(diào)查情況統(tǒng)計(jì)如表1。

2.2 多點(diǎn)控制試驗(yàn)示范過程與結(jié)果

2015年2 月—9月，試驗(yàn)期8個(gè)月，選定3 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)為試驗(yàn)場(chǎng)，灤縣興源奶牛場(chǎng)為實(shí)驗(yàn)一場(chǎng)、豐潤(rùn)區(qū)建泉奶牛場(chǎng)為實(shí)驗(yàn)二場(chǎng)、豐南中奧奶牛場(chǎng)為實(shí)驗(yàn)三場(chǎng)，各試驗(yàn)場(chǎng)均采用自繁自育方式，在開展本試驗(yàn)之前，進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，對(duì)該早期妊娠診斷技術(shù)的準(zhǔn)確率和時(shí)效性進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 唐山市奶牛養(yǎng)殖調(diào)查統(tǒng)計(jì)表

2.2.1 開展預(yù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該技術(shù)的準(zhǔn)確性

（1）試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)及試驗(yàn)動(dòng)物

2015年2月5 日，在實(shí)驗(yàn)一場(chǎng)即灤縣興源奶牛場(chǎng)選出20 頭母牛進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，其中，未配種母牛3 頭、配種在70 天以上并經(jīng)直腸觸診確認(rèn)已妊娠母牛3 頭、已經(jīng)輸精28 天待檢母牛14 頭。（2）試驗(yàn)方法

當(dāng)天對(duì)所有試驗(yàn)?zāi)概＿M(jìn)行尾根靜脈采血，收集到20 個(gè)血液樣品，嚴(yán)格按照操作規(guī)程及時(shí)檢測(cè)和結(jié)果判讀；在最后1 次輸精后60 天由經(jīng)驗(yàn)豐富的獸醫(yī)進(jìn)行直腸觸診，檢查其是否妊娠。

（3）結(jié)果與分析

應(yīng)用“奶牛早期妊娠診斷技術(shù)”對(duì)20 個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與牧場(chǎng)后期直腸觸診（PPR）方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)照情況見表2。

由表2可知，檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性有15 頭，陰性有5 頭。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品中，05號(hào)、15號(hào)、20號(hào)樣品對(duì)應(yīng)的母牛為配種60 天以上并經(jīng)直腸觸診確認(rèn)已妊娠母牛，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況一致；其余13個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的母牛的60 天觸診結(jié)果也為妊娠，檢測(cè)結(jié)果與后期驗(yàn)證結(jié)果一致。檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品中，02號(hào)、06號(hào)、10號(hào)樣品對(duì)應(yīng)的母牛為未配種奶牛，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況一致；08號(hào)、17號(hào)樣品對(duì)應(yīng)的母牛的60天觸診結(jié)果也為空懷，檢測(cè)結(jié)果與后期驗(yàn)證結(jié)果一致。結(jié)論：該技術(shù)對(duì)配種28 天及以后母牛的妊娠診斷準(zhǔn)確率100%；空懷診斷準(zhǔn)確率100%。

2.2.2 正式試驗(yàn)

（1）試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)及試驗(yàn)動(dòng)物

2015年2 月初開始，在3 個(gè)試驗(yàn)場(chǎng)同時(shí)開展正式試驗(yàn)。試驗(yàn)對(duì)象為全群1～5 胎成母牛。

2014年成母牛配種妊娠、產(chǎn)犢情況作為該試驗(yàn)的對(duì)照組，2015年2—8月的配種、妊娠、產(chǎn)犢情況作為試驗(yàn)組。

（2）試驗(yàn)方法

2015年2—9 月，對(duì)配種后28～30 天未返情的母牛采集血樣送試驗(yàn)室，使用該技術(shù)進(jìn)行妊娠診斷，根據(jù)試驗(yàn)室反饋的檢測(cè)結(jié)果由技術(shù)人員對(duì)檢出的空懷牛及時(shí)處理，再次誘導(dǎo)排卵，而后進(jìn)行人工授精，在輸精后28 天再次采血檢測(cè)。對(duì)應(yīng)用該技術(shù)前后3 個(gè)試驗(yàn)場(chǎng)的奶?？諔烟鞌?shù)變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表2 PAGs檢測(cè)結(jié)果與60 天妊娠檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表

表3 應(yīng)用該早期妊娠診斷方法前后平均空懷天數(shù)對(duì)照統(tǒng)計(jì)表

（3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2.2.3 結(jié)果與分析

應(yīng)用該技術(shù)前后3 個(gè)試驗(yàn)場(chǎng)奶牛平均空懷天數(shù)變化結(jié)果見表3。

由表3可見，應(yīng)用該技術(shù)前后，實(shí)驗(yàn)一場(chǎng)平均空懷天數(shù)分別是156.73 天和134.06 天，減少22.67天，差異極顯著（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)二場(chǎng)平均空懷天數(shù)分別是152.05天和130.25 天，減少21.80 天，差異極顯著（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)三場(chǎng)平均空懷天數(shù)分別是160.53 天和136.05 天，減少24.48 天，差異極顯著（P＜0.01）；3 個(gè)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)共統(tǒng)計(jì)了1 591 頭和1 716 頭奶牛，平均空懷天數(shù)分別是155.74 天和132.97 天，減少22.77 天，差異極顯著（P＜0.01）。

通過應(yīng)用該技術(shù)，3 個(gè)試驗(yàn)場(chǎng)平均有效減少奶牛空懷天數(shù)22.77 天，降低了飼喂成本，3 個(gè)試驗(yàn)場(chǎng)每頭牛能夠平均累計(jì)新增效益=平均有效減少奶牛空懷天數(shù)（22.7 天）×每頭牛每天的飼料成本（45.5 元/頭）-每頭牛新增的生產(chǎn)費(fèi)用（每頭牛檢測(cè)用試劑盒成本平均為35 元/頭）=22.77×45.5-35=1 001.04 元。