孔 陽, 馬養(yǎng)民*, 關(guān) 磊, 周 行, 杜樹榮

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 712100； 2.云南省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院， 云南 昆明 650051)

0 引言

白花夾竹桃(NeriumindicumMill.CvPaihua)為夾竹桃科夾竹桃屬植物[1].夾竹桃屬于強(qiáng)心類中藥，味苦、性寒、有毒，歸心經(jīng).主要功能為強(qiáng)心利尿、祛痰定喘、鎮(zhèn)痛、祛瘀.近代臨床運用該藥治療心力衰竭、喘息咳嗽、癲癇、跌打損傷等癥[2,3].植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙而沒有引起宿主明顯病害癥狀的真菌.植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的次生代謝產(chǎn)物，作為新的醫(yī)藥資源正受到廣泛的關(guān)注[4,5].

目前，關(guān)于白花夾竹桃內(nèi)生真菌的研究鮮有報道，NR3是分離自白花夾竹桃的一株內(nèi)生真菌，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗菌活性，因此本研究對NR3的次生代謝產(chǎn)物及其抗菌活性進(jìn)行了研究，以期為發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物和抗菌活性物質(zhì)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株

從秦嶺地區(qū)的白花夾竹桃(NeriumindicumMill.CvPaihua)根中分離得到內(nèi)生真菌NR3，在4 ℃下用PDA培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?

活性測試菌：細(xì)菌有革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，革蘭氏陰性菌用大腸桿菌(Enterococcuscoli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，以上菌種均由陜西省微生物研究所提供.植物病原真菌有蘋果腐爛菌(Cytosporasp.)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、芍藥炭疽病菌(Peonylongipes)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsic)，以上菌種由陜西科技大學(xué)微生物實驗室提供.

1.2 材料與儀器

1.2.1 儀器及試劑

(1)主要儀器：SW-CJ-1FD 超凈工作臺(上海博迅)；YX280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申)；DH5000B 電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特)；電子天平(北京賽多利斯)；HZQ-Q型全溫數(shù)顯振蕩器(金壇瑞華).

(2)主要試劑：瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏(北京奧博星)；葡萄糖、蔗糖(上海化學(xué)試劑公司)；DMSO、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉、七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀(天津博迪化工)；其余試劑均為分析純.

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然.

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，食用鹽5 g，瓊脂20 g，H2O 1 000 mL pH自然.

(3)察氏液體培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO32 g，KCl 0.5 g，Mg SO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41 g ，水1 000 mL，pH自然[6].

(4)大米固體培養(yǎng)基：每100 g大米加入120 mL無糖察氏液體培養(yǎng)基.

1.3 夾竹桃內(nèi)生真菌NR3的鑒定

將菌株NR3接種于PDA斜面培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)3 d至孢子成熟，利用CTAB法[7]提取菌絲體基因組DNA.以提取到的基因組DNA為模板，通過引物ITS1F和ITS4R擴(kuò)增目標(biāo)菌株的ITS區(qū).將測序獲得的ITS序列通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，利用MEGA6.06軟件采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，再結(jié)合形態(tài)學(xué)方法對菌株NR3進(jìn)行鑒定[8].

1.4 次生代謝產(chǎn)物的分離純化

1.4.1 內(nèi)生真菌NR3的發(fā)酵

將菌株NR3種子液接種于大米固體培養(yǎng)基(100 g大米，120 mL無糖察氏培養(yǎng)基)中，28 ℃培養(yǎng)20天后，將發(fā)酵產(chǎn)物陰干粉碎，用95%乙醇回流提取3次，回收溶劑得次生代謝產(chǎn)物粗提物430 g，置于無菌瓶中2 ℃低溫保存.

1.4.2 代謝產(chǎn)物的分離純化

將NR3乙醇提取物430 g溶解于甲醇中，再與等量硅膠混和均勻，待溶劑完全揮干之后，進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚、石油醚/乙酸乙酯=1∶1、石油醚/乙酸乙酯=1∶2、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇=1∶1、乙酸乙酯/甲醇=1∶2、甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，混合溶劑系統(tǒng)和乙酸乙酯:甲醇混合溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.1～7共七相，F(xiàn)r3再進(jìn)行Flash中壓液相色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，得到化合物1(14 mg)、化合物2(13 mg)，F(xiàn)r.4再進(jìn)行Flash中壓液相色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，分別得到化合物3(20 mg)、化合物4(21 mg).Fr.5和等量硅膠混合進(jìn)行Sephadex LH-20柱色譜分離，得到化合物5(16 mg)、化合物6(11 mg)和化合物7(26 mg).

所有化合物用核磁共振儀測定其1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu).

1.5 樣品最小抑菌濃度(MIC)測定

采用二倍稀釋法[9]，將各樣品溶解于DMSO溶劑中，配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液.將滅菌的培養(yǎng)基用微量移液器吸取100μL到96孔板的每孔中，再向第1孔中加入配制好的樣品溶液100μL，混合均勻后從第1孔中吸取100μL加入到第2孔中，混合均勻后再從第2孔中吸取100μL加入到第3孔中，按照此法連續(xù)稀釋至第10孔，然后從第10孔中吸取100μL棄去，第11孔和第12孔作為培養(yǎng)基和DMSO溶劑空白對照.96孔板上的第1～10孔的樣品濃度分別為125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.63μg/mL、7.82μg/mL、3.91μg/mL、1.96μg/mL、0.98μg/mL、0.49μg/mL和0.25μg/mL.

用培養(yǎng)基配制濃度為106CFU/mL的指示菌菌懸液(細(xì)菌用平板菌落計數(shù)法，真菌采用孢子計

數(shù)法[10])，分別向每孔中加入100μL的菌懸液.其中選用對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好抑制作用的頭孢呋辛鈉作為陽性對照，選用多菌靈(酮康唑)作為植物病原真菌的陽性對照，DMSO試劑作為陰性對照，每組實驗做3次平行.將細(xì)菌實驗組的96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，植物病原真菌實驗組的96孔板置于28 ℃培養(yǎng)48 h后置于黑色背景下觀察溶液是否有沉淀或渾濁，當(dāng)某一混合溶液透明澄清，則說明化合物在此濃度可以抑制該菌生長，該濃度即為樣品的最小抑菌濃度MIC，并記錄樣品的最小抑菌濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 NR3基因序列結(jié)果

內(nèi)生真菌NR3通過ITS測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，利用MEGA6.06軟件采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(見圖1),再結(jié)合形態(tài)學(xué)方法對菌株NR3進(jìn)行鑒定[8]，初步確定菌株NR3為煙曲霉(Aspergillusfumigatus).

圖1 基于ITS序列的NR3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

采用核磁共振光譜1HNMR、13CNMR及二維核磁HSQC、HMBC數(shù)據(jù)，結(jié)合理化性質(zhì)鑒定單體化合物結(jié)構(gòu)，最終確定7個化合物，結(jié)構(gòu)式見圖2所示.

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇，365 nm紫外光下顯藍(lán)色熒光，用5%的濃硫酸乙醇顯色呈淺黃色.1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：9.44(s，1H)為NH氫的吸收峰；7.02(dd，J=8.0 Hz，1H，4-H)，7.56(1H，td，J=16 Hz，5-H)，7.12(td，1H，J=12 Hz，6-H)，7.16(1H，dd，J=16 Hz，7-H)，3.07(s，3H，10-H)，6.12(t，1H，J=4.0 Hz，12-H)，6.68(dt，1H，J=4.0 Hz，14-H)，6.98(t，1H，J=8.0 Hz，15-H)，6.01(d，1H，J=8.0 Hz，16-H)，4.25(s，1H，17-H).13CNMR (100 MHz，DMSO)顯示出17個碳信號，δ：165.92(C-1)，70.08(C-2)，165.31(C-3)，130.48(C-4)，132.28(C-5)，124.19(C-6)，121.02(C-7)，135.04(C-8)，126.42(C-9)，30.81(C-10)，132.32(C-11)，112.7(C-12)，156.85(C-13)，115.64(C-14)，128.86(C-15)，116.92(C-16)，63.68(C-17).核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]一致，確定化合物1為圓弧菌醇(eyelopenol)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物2：白色片狀結(jié)晶，mp.125 ℃～126 ℃，微溶甲醇，溶于DMSO.1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6) ，δ:4.49 (2H，d，J=4.0 Hz，1，4-OH)，4.36(2H，t，J=8.0，4.0 Hz，2，3-OH)是4個羥基氫信號，δ:3.6～3.8 間的多重峰為連氧的CH2和CH的氫信號.13C-NMR(100 MHz，DMSO) 顯示有2個連氧碳信號δ:73.49(C-2，3)，63.21(C-1，4).綜上所述并與文獻(xiàn)[12]的核磁數(shù)據(jù)對照，確定化合物2為赤蘚醇 (erythritol)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物3：白色粉末，mp.290 ℃～291 ℃，溶于DMSO，用5%的濃硫酸乙醇顯色呈現(xiàn)紫紅色.1HNMR (400 MHz，DMSO-d6) 氫譜提示含有甾體母核，Molish反應(yīng)陽性，提示該化合物可能含有糖.δ:0.66 ( 3H，s，J=6 Hz，H-18)，0.79(3H，d，J=8 Hz，H-27)，0.81(3H，t，J=8 Hz，H-29)，0.83(3H，d，J=8 Hz，H-26)，0.9(3H，d，J=4 Hz，H-19)，0.96(3H，d，J=10 Hz，H-21)為6個甲基信號峰，4.21～4.89之間有6個氫質(zhì)子信號，推測分子中含有糖，5.33(1H，s，H-6)，4.45(1H，s，H-3).13CNMR(100 MHz，DMSO)顯示出35個碳信號，δ:140.74(C-5)，121.39(C-6)顯示低場區(qū)有2個烯碳信號； 19.68(C-27)，19.07(C-19)，18.90(C-21)，18.58(C-26) ，11.75(C-29)，11.64(C-18)顯示高場區(qū)有6個甲基信號.綜上所述并與文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)對照，確定化合物3為胡蘿卜苷(Daucosterol)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物4：白色蠟狀，mp.63 ℃～64 ℃.易溶于氯仿，用5%的濃硫酸反應(yīng)顯紫紅色.1H-NMR (400 MHz，CDCl3) ，δ: 0.88(3H，t，J=8.0 Hz，H-2)是末端甲基的信號，2.35(2H，t，J=8.0 Hz，H-16)是一連接羰基的亞甲基，顯示了脂肪酸的特征峰.13C-NMR (100 MHz，CDCl3)，δ:179.84(C-1)顯示低場有一個羧酸羰基碳， 以及15個飽和碳原子33.57(C-2)，32.15(C-3)，29.20～28.55(C-4～13)，24.16(C-14)，22.2(C-15)，13.64(C-16).綜上所述并與文獻(xiàn)[14]對照，確定化合物4為十六烷酸(palmiticacid)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物5：白色粉末，mp.139 ℃～141 ℃，易溶于氯仿，用5%的濃硫酸乙醇顯色呈現(xiàn)紫紅色，冷卻褪色后為灰綠色.1HNMR(400 MHz，CDCl3)，δ：5.36(1H，m，H-6)顯示低場有一個烯氫吸收峰；3.53(1H，m，3-OH)是連在羥基碳上的吸收峰；1.01(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=8 Hz，H-21)，0.84(3H，s，H-27)，0.82(3H，s，H-26)，0.80(3H，s，H-29)，0.68(3H，d，J=8 Hz，H-18)顯示高場有6個甲基信號.13CNMR (100 MHz，CDCl3)顯示出29個碳信號，δ:140.26(C-5)，121.24(C-6)顯示低場有2個烯碳信號；19.54(C-19)，18.92(C-26)，18.54(C-27)，18.29(C-21)，11.49(C-18)，11.37(C-29)是6個甲基碳峰.綜上所述與文獻(xiàn)[15]數(shù)據(jù)對照，化合物5鑒定為β-谷甾醇(β-sitostero)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物6 ：白色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇，mp.163 ℃～165 ℃.1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：4.42(2H，d，J=5.4 Hz，2，5-OH)，4.32(2H，t，J=5.6 Hz，1，6-OH)，4.16(2H，d，J=7.2 Hz，3，4-OH)，3.48(2H，m，2，5-H)；13CNMR(100 MHz，DMSO d6)δ：71.2(C-3，4)，69.6(C-2,5)，63.7(C-1,6).與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)對照，確定化合物6為甘露醇(mannitol)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

化合物7：白色針狀結(jié)晶，易溶于乙酸乙酯、甲醇，5%硫酸-乙醇溶液反應(yīng)顯紫紅色.1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：10.34(1H，S)，10.91(1H，S)，11.77(1H，S)是3個羥基氫信號，2.7(3H，S，H-7′)是一個甲基氫信號.13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：138.07(C-1)，97.36(C-2)，164.02(C-3)，100.81(C-4)，165.35(C-5)，104.25(C-6)，164.65(C-7)，108.91(C-1′)，152.56(C-2′)，101.55(C-3′)，158.36(C-4′)，117.47(C-5′)，138.27(C-6′)，25.19(C-7′).核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物7為交鏈孢酚(Alternariol)，結(jié)構(gòu)式見圖2.

2.3 樣品的抑菌活性研究結(jié)果

2.3.1 樣品對細(xì)菌的MIC測定結(jié)果

利用二倍稀釋法對樣品抗細(xì)菌的能力進(jìn)行測定，指示菌有革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)和乳鏈球菌(S.agalactiae),革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，實驗結(jié)果如表1所示.

表1 樣品對不同細(xì)菌的最小抑菌濃度

注：A金色葡萄球菌；B乳鏈球菌；C大腸桿菌；D銅綠假單胞菌

化合物1對革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)抑制作用MIC為7.82μg/mL，對革蘭氏陽性菌也有較強(qiáng)的抑制作用MIC為15.63μg/mL.化合物7對供試的四種細(xì)菌都具有很強(qiáng)的抑制作用，MIC均為7.82μg/mL.化合物4、5對供試細(xì)菌有一定的抑制作用，而化合物2、3、6幾乎沒有抑菌效果.

由此可見，以苯二氮類化合物為基本母核的化合物1和以香豆素為母核的化合物7對革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌都具有很好的抑制作用，可以對二者抑制其它細(xì)菌的活性做進(jìn)一步研究.相反，化合物2和6對供試細(xì)菌基本無作用，二者都是多羥基醇，易溶于水有一定甜味，此類化合物對細(xì)菌基本沒有抑制作用.化合物3是甾體皂苷類化合物，對供試細(xì)菌沒有生理活性或許與其水溶性很差有關(guān).

2.3.2 樣品對植物病原真菌的MIC測定結(jié)果

利用二倍稀釋法對樣品抑制植物病原真菌的能力進(jìn)行測定，指示菌為蘋果腐爛菌(Cytosporasp.)，白菜黑斑病菌(A.brassicae),芍藥炭疽病菌(P.longipes),辣椒疫霉病菌(P.thoracapsic)，樣品對植物病原菌的最小抑菌濃度結(jié)果如表2所示.

表2 樣品對植物病原真菌的最小抑菌濃度

注：E蘋果腐爛病菌；F白菜黑斑病菌；G芍藥炭疽病菌；H辣椒疫霉病菌

從表2的結(jié)果可以看出，化合物7對供試的四種植物病原菌都有很強(qiáng)的抑制作用，對于芍藥炭疽病菌和辣椒疫霉菌的抑制活性甚至超過了陽性對照多菌靈，MIC分別為1.96μg/mL和3.91μg/mL.化合物1與7對供試的白菜黑斑菌也具有較好的抑制作用，MIC為7.82μg/mL，對蘋果腐爛菌的抑制作用也較強(qiáng)，MIC為15.63μg/mL.

綜上所述，以苯二氮類化合物為基本母核的化合物1和以香豆素為母核的化合物7不僅對細(xì)菌有很好的抑制作用，對供試的植物病原菌抑制作用也非常明顯.尤其是化合物7，抑菌作用與多菌靈相比效果更好，可以進(jìn)一步作為天然抑菌劑進(jìn)行研究開發(fā).

3 結(jié)論

從白花夾竹桃內(nèi)生真菌NR3的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到7個化合物，分別為一個苯二氮類化合物(圓弧菌醇)、兩個多元醇(赤蘚醇和甘露醇)，兩個甾體類化合物(胡蘿卜苷和β-谷甾醇)、一個脂肪酸(十六烷酸)和一個香豆素類化合物(交鏈孢酚)，以上7種化合物在白花夾竹桃的內(nèi)生真菌中均為首次分離得到.抑菌活性結(jié)果顯示，NR3能產(chǎn)生具有很強(qiáng)廣譜抗菌活性的化合物.由此可見，夾竹桃內(nèi)生真菌NR3的次級代謝產(chǎn)物豐富，后期可以繼續(xù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，期望能得到更多抑菌效果較好、結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物.