趙莎

（西安培華學院，陜西西安 710125）

膠原蛋白廣泛存在于各種生物體，因其生物相容性和低抗原性而廣泛應用于食品、保健食品等多個領域[1]。魚鱗的相對分子質量大且分子結構復雜，其水解物膠原多肽相對分子質量低、滲透性好、親水性強而應用廣泛。我國是當今世界淡水養(yǎng)殖業(yè)最為發(fā)達的國家之一，據統(tǒng)計每年淡水魚加工業(yè)的廢棄物中魚鱗約為30萬噸[2]。有關研究表明，魚鱗的主要成分為膠原蛋白，占魚鱗總質量的50%～70%[3]。草魚作為四大家魚之一，其水產品加工產生大量魚鱗、魚骨等廢棄物[4]，為了充分利用這些廢棄物，本研究以草魚魚鱗為原料，對Alcalase蛋白酶制備魚鱗膠原多肽的水解工藝進行初步研究。

1 實驗材料與設備

1.1 材料與試劑

草魚魚鱗，購于西安培華學院門口菜市場；Alcalase堿性蛋白酶（2.4 AU/g），意諾聯創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9240A電熱鼓風干燥箱儀器，上海一恒科學儀器有限公司生產；GL-20G-Ⅱ高速離心機，上海安亭科學儀器廠生產；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司生產。

2 實驗方法

2.1 脫鈣魚鱗的制備

將草魚魚鱗取純凈水清洗干凈，用紗布吸干表面水分，去除魚皮和魚肉，加入15倍體積的0.4 mol/L鹽酸，室溫反應3 h后，再用純凈水清洗，再放置鼓風干燥箱烘干，脫鈣魚鱗制備完成。

2.2 Alcalase蛋白酶對草魚魚鱗提取草魚魚鱗膠原多肽粉

將烘干的草魚脫鈣魚鱗進行預處理，Alcalase蛋白酶對其進行水解再進行滅酶，酶解結束后用0.3%活性炭進行去腥、脫色，再進行高速離心后取上清液進行冷凍干燥，干燥后即為所得到的膠原多肽粉。

2.3 預處理溫度對膠原多肽提取的影響

稱取10 g處理過的脫鈣魚鱗，加入100 mL ddH2O，分別于50 ℃、100 ℃及121 ℃加熱10 min，然后于加酶量為0.07 AU/g，底物質量分數為5%，在60 ℃條件下反應3 h左右。

2.4 酶解膠原多肽最佳工藝的研究

2.4.1 加酶量對膠原多肽提取率的影響

用電子天平稱取10 g脫鈣魚鱗，加100 mL ddH2O，于121 ℃條件下預處理10 min，再分別加入濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 AU/g和0.10 AU/g的Alcalase蛋白酶，在60 ℃條件下反應3 h，徹底水解后進行滅酶（100 ℃水浴10 min），酶解結束后0.3%活性炭進行去腥、脫色，后于4 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL進行酶解消化，再用凱氏定氮法測定多肽含量。

2.4.2 酶解時間對膠原多肽提取率的影響

取10 g脫鈣魚鱗混合于100 mL ddH2O中，于121 ℃預處理10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，于60℃反應1、1.5、2、2.5、3、3.5 h及4 h，后續(xù)操作同2.4.1。

2.4.3 酶解溫度對膠原多肽提取率的影響

用電子天平稱取10 g處理好的脫鈣草魚魚鱗，加至 100 mL ddH2O中，于121 ℃預處理 10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，分別于40、45、50、55、60、65 ℃和70 ℃溫度下保溫3 h，后續(xù)操作同2.4.1。

2.4.4 底物質量分數對膠原多肽提取率的影響

分別稱取 5、10、15、20 g及25 g處理好的脫鈣草魚魚鱗，分別加入100 mL ddH2O并充分混合，預處理條件為121 ℃、10 min，再加入Alcalase蛋白酶的量為0.07 AU/g，于60 ℃反應3 h，后續(xù)操作同2.4.1。

3 結果與分析

3.1 預處理溫度對酶解作用的影響

將10 g脫鈣鯉魚魚鱗與100 mL ddH2O蒸餾水混勻，分別于50 ℃、100 ℃和121 ℃條件加熱10 min，按照上述加酶量取適量Alcalase蛋白酶，底物濃度15%、60 ℃條件下反應3 h，魚鱗膠原多肽提取率如圖1所示。由圖1得出，魚鱗膠原多肽提取率會隨著溫度的升高而顯著增加。造成這種原因可能是由于隨著壓力和溫度的升高，膠原蛋白多肽鏈的空間結構變性，有利于Alcalase蛋白酶對其水解作用。

圖1 預處理溫度對膠原多肽提取的影響

3.2 膠原多肽酶解工藝研究

3.2.1 加酶量對蛋白提取率的影響

從圖2可知，加酶量在0.02～0.07 AU/g時，增加加酶量使得蛋白的提取率顯著增長，出現這種情況的原因可能是增加加酶量會使得酶與底物結合的概率加大，其水解程度明顯增強。當加酶量達到0.07 AU/g時，膠原蛋白提取率達到最高，后再增加加酶量提取率降低，這可能由于加酶量達到一定程度將幾乎所有反應底物徹底反應掉[5]。反應底物已耗盡，增加酶量無法使水解度得到顯著提高，因此選擇最佳加酶量為0.07 AU/g。

3.2.2 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖3可知，Alcalase堿性蛋白酶在催化反應前期存在較高活性，在約3 h時魚鱗膠原蛋白進行酶解提取率最高。隨著酶解時間的增加，膠原蛋白的提取率不變，可能是3 h以后膠原蛋白質量分數比較高導致提取液變黏稠，阻止了酶與底物接觸，再增加反應時間也不會使得膠原蛋白含量顯著升高[6]。因此，選擇3 h為最佳時間。

圖2 Alcalase蛋白酶加酶量對膠原多肽提取率的影響

圖3 Alcalase蛋白酶酶解時間對膠原多肽提取率的影響

3.2.3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

實驗得出酶解溫度在50～60 ℃時，酶解液中蛋白質含量明顯升高，達到60 ℃時，蛋白質提取率可達到最高。隨著酶解溫度繼續(xù)升高，酶解速度逐漸下降，可能是在酶最適溫度以下，隨著溫度的升高反應物的能量和分子間有效接觸的頻率增加。當溫度過高酶分子吸收了過多能量，維持酶蛋白分子的次級鍵斷裂，使得Alcalase酶蛋白變性，酶活性由此降低甚至喪失。選擇60 ℃為最佳酶解溫度。

3.2.4 底物質量分數對蛋白提取率的影響

實驗得出在反應底物質量分數越高，提取率增長越快，在15%的底物質量分數條件下，Alcalase蛋白酶酶解達到最高。隨著反應底物的質量分數繼續(xù)增高，膠原蛋白提取率幾乎不變。這可能是由于底物質量分數過高，引起水解反應液黏度過高，從而影響蛋白酶與底物的接觸，酶解反應速度降低并抑制水解反應。因此，選擇15%為反應底物質量分數。

4 結論

本實驗中選取樣本草魚魚鱗含有豐富的膠原蛋白量，作為制備水解膠原蛋白的良好原料。采用Alcalase蛋白酶水解草魚魚鱗膠原蛋白，具有水解反應條件溫和，反應速度快等優(yōu)點。