彭書東 ，李鍵，劉士健，張玉，王洪偉，趙欣，索化夷*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067) 3(西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都，610041)

乳酸菌長期應用在食品中，對食品的風味、質構和感官品質具有非常重要的作用，是公認的一般安全菌。其中的一些代謝產物，如酸、過氧化氫、和細菌素等具有抑制食源性致病菌和食品腐敗菌的作用。細菌素由于其蛋白質性質，成為了人們關注的主要對象。一般認為細菌素是由細菌或古細菌基因編碼，核糖體合成的一類抗菌蛋白或多肽，能抑制或殺死近緣菌株或其他種屬菌株，但產生菌對其所產細菌素具有耐受作用[1]。根據2005年COTTER等[2]重新修訂的細菌素分類方法將細菌素分為3類：Ⅰ類屬于羊毛硫抗生素；Ⅱ類屬于非羊毛硫抗生素，Ⅱ類進一步分為4小類：a類片球菌素，b含雙肽鏈，c含環(huán)狀，d非片球菌素單一線性肽；Ⅲ類包含一些大的熱不穩(wěn)定細菌素。細菌素由于其安全、無毒和易于工業(yè)化生產等優(yōu)點，在食品防腐領域具有很好的應用前景。細菌素是初級代謝產物，可以通過生物工程技術優(yōu)化其生物活性。不同于抗生素，細菌素是真正的蛋白類物質，而抗生素是通過酶促反應形成的二級代謝物。細菌素大多數是窄譜抑菌，而且無毒、無污染、無副作用、無抗藥性；它的使用可以減少或取代抗生素的使用[3]。細菌素一般具有良好的耐熱性、耐酸堿性、且對蛋白酶敏感。大多數細菌素只可以抑制革蘭氏陽性菌，少數細菌素，還可以抑制革蘭氏陰性菌和真菌，如PEI等[4]提純的植物乳桿菌素SLG1(plantaricin SLG1)不但可以抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性，菌還可以抑制一些真菌。但是到目前為止，只有乳酸鏈球菌素(Nisin)作為食品防腐劑應用在食品中。

細菌素作為抗菌劑具有很多優(yōu)點，但是在實際應用中受到很多挑戰(zhàn)，比如細菌素的合成機制、抑菌機制尚未明確，以及在實際應用中細菌素作用效果不穩(wěn)定，易受到其他物質影響。本文對Ⅰ類細菌素、Ⅱ類細菌素生物合成機制，篩選和鑒定的方法、抑菌機制及其包埋技術的研究進展進行綜述，以促進細菌素的研究和應用的深入開展。

1 細菌素生物合成機制

在幾類細菌素中，Ⅰ類細菌素和Ⅱ類細菌素的生物合成機制研究最多。Ⅰ類細菌素是指羊毛硫抗生素，含有一個或者多個修飾的氨基酸殘基，如羊毛硫氨酸、β-甲基-羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸等；而Ⅱ類細菌素不含修飾的氨基酸殘基。因此調控兩類細菌素產生的機制存在差異，兩類細菌素的合成機制最大的不同就是在調控Ⅰ類細菌素產生的過程中有修飾氨基酸基因的表達，而Ⅱ類細菌素則沒有。調控Ⅰ類、Ⅱ類細菌素的基因具有相似的功能，即含有編碼基本結構的基因，編碼轉運蛋白的基因，編碼免疫蛋白的基因，還可能含有編碼肽成熟相關的基因。

1.1 Ⅰ類細菌素合成機制

Ⅰ類細菌素主要有Nisin、枯草菌素(subtilin)、表皮素(epidermin)等。其中關于nisin的研究最廣泛，并且nisin基因簇結構復雜，含有11個基因，分別命名為nisABTCIPRKFEG, 分為4個操縱子nisABTCIPRK，nisI，nisRK和nisFEG[5]。其中nisA編碼Nisin的前體多肽，含有57個氨基酸殘基；nisB編碼一種與膜相關的酶，使絲氨酸脫水生成脫氫丙氨酸，蘇氨酸脫水生成脫氫酪氨酸；nisC編碼一種環(huán)化酶，使脫水殘基與半胱氨酸結合形成環(huán)；nisT編碼ABC轉運蛋白使修飾過的多肽通過細胞膜；nisP編碼一種裂解酶使Nisin的N-末端前導序列裂解，裂解后的Nisin才具有生物活性，才可以誘導nisRK和免疫基因的表達。

基因nisABTCIPRK的功能研究已經比較清晰，但是nisI,nisRK和nisFEG具體功能還不是十分清楚。最近的研究表明nisI編碼一種脂蛋白nisI，該蛋白賦予產生菌對Nisin的耐受力。NisI主要通過2種方式保護產生菌，一種是直接與nisin結合，另一種是nisI的C-末端氨基酸促使細胞聚集成鏈，造成Nisin不能與類脂Ⅱ接觸[6]。另外nisFEG也會編碼ABC轉運蛋白阻止nisin進入細胞膜，蛋白nisFEG會識別Nisin的C-末端氨基酸，使Nisin轉運出膜[7]。通過這2種基因編碼的蛋白，使Nisin產生菌得到很好的保護。nisRK構成Nisin生物合成的雙調控系統(tǒng)，可以調節(jié)Nisin的產量。汪蕊等[8]將含有nisRK基因的載體轉入乳酸乳球菌N401(LactococcuslactisN401)菌株，使nisRK基因超表達，發(fā)現Nisin Z的產量提高了45%左右。

1.2 Ⅱ類細菌素生物合成機制

Ⅱ類細菌素中較常見的有3種：片球菌素(pediocin)、plantaricin和腸球菌素(enterocin)。pediocin是Ⅱa類細菌素，是由4個操縱子調控，即pedA、pedB、pedC、pedD。其中pedA編碼pediocin前體，pedB編碼免疫蛋白；pedC編碼肽成熟有關的酶；pedD編碼一種ABC轉運蛋白-pedD[9]。Plantaricin NC8是植物乳桿菌NC8(LactobacillusplantarumNC8)產的一種Ⅱb類細菌素，由ClaI上的2個基因plNC8α和plNC8β編碼多肽前體，并且N-末端的前導序列含有雙甘氨酸。在ClaI上的1個orfC存在編碼免疫蛋白相關的基因[10]。而多肽前體到成熟肽需要的相關基因和編碼ABC轉運蛋白的基因尚不清楚。已有的研究發(fā)現，調控plantaricin產生的基因需要添加自誘導多肽或者與特定菌株共培養(yǎng)才能產生細菌素[11]。Enterocin Q是屎腸球菌L50(EnterococousfaeciumL50)產生的一種Ⅱc類細菌素，編碼這一細菌素的基因位于質粒上。與Nisin、pediocin不同的是編碼enterocin Q的操縱子只需entqA、entqB、entqC三個就可以完成。其中entqA編碼enterocin Q的結構多肽，不含前導序列，因此不需要成熟相關的酶；entqB編碼一個ABC轉運蛋白；entqC編碼一個免疫蛋白[12]。

2 產細菌素乳酸菌的篩選以及細菌素種類的鑒別方法

2.1 產細菌素乳酸菌的篩選方法

目前產細菌素乳酸菌篩選最常用的方法是瓊脂擴散法，這是利用待檢測菌在瓊脂表面對指示菌的生長顯示抑制效果的一種定性分析抑菌譜的篩選方法[13]。瓊脂擴散法具體又可分為牛津杯法、打孔法、濾紙片發(fā)和點種法等。如董雨馨等[14]利用牛津杯法從廣西米粉中篩選出一株產細菌素的植物乳桿菌；孫杰等[15]利用打孔法從米酒中篩選出一株植物乳桿菌WZS02也產細菌素。瓊脂擴散法廣泛用于細菌素的篩選是由于其具有操作簡單、結果直觀等優(yōu)點；但在實際應用中也有一些缺點。其中一個問題就是細菌素在瓊脂中不能很好的擴散，造成抑菌效果不明顯。WOLF等[16]向培養(yǎng)基中加入吐溫-20加快了細菌素的擴散，但擴散時間和瓊脂量對結果的影響依然存在。另一問題是該方法具有高度的主觀性，同時在測抑菌圈時，錯誤程度很高并且重復性很低。因此需要一種更加靈敏、快速、簡便的產細菌素菌株的篩選方法。通過乳酸菌編碼細菌素的基因序列設計特定引物，再利用PCR擴增進行篩選是目前研究較多的快速篩選方法。YI等[17]根據Ⅱa類細菌素保守氨基酸序列(-YGNGVXCXXXXCXV-和-LDNAIE-)設計簡并引物，并建立基于菌落-PCR(Colony-PCR)法的產Ⅱa類抗菌肽乳酸菌的快速篩選方法，能快速、有效地篩選出產Ⅱa類細菌素的菌株。但由于特異性靶點過少或特異性不強，使用該方法容易導致在PCR擴增過程中產生非特異性產物,使得擴增的目標產物濃度過低，難以回收?；赑CR技術構建細菌素高通量篩選平臺是下一步研究的主要篩選方法，但目前還處于初始研究階段，還有許多待解決的問題。

2.2 細菌素種類的鑒別方法

傳統(tǒng)的乳酸菌產細菌素種類鑒定的方法是首先將細菌素提純，再測定N-末端的氨基酸序列進行比對；同時結合凝膠電泳和質譜測出肽段的分子質量，進而鑒別出細菌素的種類[18]。在提純過程中使用離子色譜、反相液相色譜等分離技術，該類技術過程復雜、耗時并且提純率低。因此需要一種更簡便、高效的細菌素鑒別方法。近些年，通過PCR分析方法鑒別乳酸菌產的細菌素種類已有許多研究。如吳軼等[19]根據已發(fā)現的plantaricin基因設計引物，對目標菌的DNA進行PCR擴增發(fā)現植物乳桿菌LD 1.0008含有：plnD、plnO、plnV和plnW四個相關基因，從而確定菌株LD 1.0008具有產這4種基因編碼的細菌素的潛力。SAENZ等[20]根據已發(fā)現的27種plantaricin基因設計引物，對33株植物乳桿菌進行PCR分析，發(fā)現有31株菌含有已知的plantaricin基因，從而快速確定這些菌株可能產的細菌素種類。雖然通過基因分析可以快速鑒定出菌株產生的細菌素種類，但是最終細菌素基因是否表達，還需作進一步分析。

3 細菌素的抑菌機制

目前關于細菌素的抑菌機制的研究有很多，但是大多數的研究僅關注于細菌素對目標菌的損傷方式，即：在細胞膜上形成孔、抑制細胞壁合成等。關于細菌素作用的分子機制研究得很少，目前報道最多的是Nisin。根據已有的研究表明,細菌素作用的分子機制是復雜的，作用于細胞膜上的目標不是單一的。

3.1 Ⅰ類細菌素的抑菌機制

在羊毛硫細菌素中，研究最多的就是Nisin，主要有2種抑菌機制：一種是在細胞膜上形成孔，另一種是抑制細胞壁的合成來抑制菌的生長。研究發(fā)現，Nisin作用科氏葡萄球菌22(Staphylococcuscohnii22)后造成ATP、K+等陽離子流出細胞[21]，從而造成了膜電勢的損失，抑制了菌的生長。STRAHL等[22]研究發(fā)現電勢的損失會使細胞骨架蛋白MreB，Mbl等螺旋性損失，隔膜中的細胞分裂蛋白FtsA，FtsZ等減少，這對細菌的生長造成了嚴重的影響。胞內物質的損失，是由于Nisin作用于細胞膜形成了孔，孔的形成與Nisin肽鏈的5個環(huán)有很大關系。從圖1、圖2可看出肽鏈的a、b、c 3個環(huán)與類脂Ⅱ的N-乙酰胞壁酸-五肽部分以及焦磷酸鹽結合，環(huán)c和d之間的鉸鏈區(qū)域促進Nisin滲透進膜，環(huán)d和e形成孔，形成的孔結構統(tǒng)一并且包含8個Nisin和4個類脂Ⅱ分子[23-24]。另外，NisinN-端的氨基化合物和類脂Ⅱ的部分焦磷酸鹽之間形成了5個氫鍵，維持孔的穩(wěn)定[25]。Nisin還可以隔離類脂Ⅱ來抑制細胞壁的合成，從而造成細胞的裂解[26]。這也解釋了一些羊毛硫抗生素太短不能透過細胞膜雙分子層形成孔，但是其仍有抑菌作用的原因。以上2種抑菌機制都與細胞壁的前體物質類脂Ⅱ相關[27]。Nisin并不是只與類脂Ⅱ相互作用，與膜上其他的磷脂也有作用。已有的研究表明，類脂Ⅱ在細菌膜上的含量相對較少，但是Nisin仍能使其膜形成孔[28]。PRINCE等[29]也發(fā)現一定濃度的Nisin對缺失類脂Ⅱ的細胞膜也會造成嚴重變形。同時也說明了Nisin抑菌是一個復雜的過程，還存在未知的機制。

圖1 Nisin和類脂Ⅱ分子結構Fig.1 Structure of Nisin and lipid II

圖2 Nisin靶向定向孔形成機制的模型Fig.2 Model for the target-directed pore-formation mechanism of Nisin

3.2 Ⅱ類細菌素的抑菌機制

目前的研究表明Ⅱ類細菌素的作用方式與Ⅰ類細菌素相似，是通過破壞細胞膜造成細胞質的損失等方式來抑制菌的生長。李麗[30]研究發(fā)現pediocin的作用位點在細胞膜上，形成短期的非選擇性穿膜孔道，造成細胞內小分子物質如氨基酸、離子和ATP等泄露，使敏感菌細胞需能反應休止而死亡。Plantaricin也具有類似的抑菌效果，由植物乳桿菌 B-28產的細菌素使蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)細胞內的ATP迅速減少，K+和Na+快速釋放，菌體細胞變形[31]。另外在plantaricin K25處理蠟樣芽孢桿菌之后，細胞膜上也會形成孔并且膜滲透性增加，細胞內容物外泄[32]。由EnterococousfaeciumC1產的細菌素BacC1，通過細胞染料(sytox green)的膜透化實驗，發(fā)現細菌素破壞了細胞膜進而抑制菌的生長[33]。Ⅱ類細菌素的作用方式目前研究比較清楚，但Ⅱ類細菌素作用的分子機制還不十分清楚。已有的研究認為，Ⅱ類細菌素是作用細胞膜上的磷脂，但是否是類脂Ⅱ還未見報道。另外，MASIAS等[34]發(fā)現高濃度的enterocin CRL35不僅改變了細胞膜的疏水核心，還破壞了葡萄糖的轉運。KJOS等[35]研究表明，單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)(mannose phosphate transferase system，Man-PTS)是Ⅱa類細菌素的作用受體，并且Man-PTS的減少會增加李斯特菌耐細菌素的能力。這也說明了Ⅱa類細菌素作用機制不是單一的，是多樣化的。

4 細菌素在食品中的應用

食品腐敗菌和食源性致病菌普遍存在食品中，對人類健康、經濟造成了嚴重影響。據統(tǒng)計，從1998年到2016年美國爆發(fā)了19 986例食源性疾病，387 788個人患病，15 562個人住院，361個人死亡[36]。食品工業(yè)生產中已經采取了各種措施去避免和抑制有害菌的污染，比如添加食品添加劑、改善加工工藝等。其中細菌素是天然保護劑，相比其他化學試劑有著巨大優(yōu)勢，但是到目前為止，官方只允許Nisin用于食品工業(yè)，主要應用在牛奶和肉制品中。

4.1 Nisin在食品中的應用

Nisin在食品中關于抑菌的研究有很多。OLADUNJOYE等[37]用5 000 IU/mL的Nisin處理鮮切番茄，發(fā)現可以有效抑制Listeriamonocytogenes的生長。NA-KYOUNG等[38]在牛肉干儲存3 d過后用100 IU Nisin/g處理，儲存21 d后用500 IU Nisin/g處理，有效地延長了貨架期以及抑制了微生物的生長。GHARSALLAOUI等[39]添加2.5～12.5 mg/kg的Nisin到真空處理的韓國調味牛肉中，發(fā)現可以抑制枯草芽孢桿菌的生長。并且Nisin在食品工業(yè)中也有較多的實際應用，比如Nisin已添加在奶酪、奶油、巴氏滅菌奶、蔬菜罐頭、酒精飲料等產品中用作防腐[40]。

4.2 其他細菌素在食品中的應用

其他細菌素應用在食品中也有研究，在2000年的時候，enterocin A和B添加到肉制品中具有很好的抗Listeriamonocytogenes的效果[41]。enterocin AS-48在蛋液中，以Bacilluscereus和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為目標菌，在4 ℃和28 ℃下最低殺菌濃度分別是5和0.05 μg/mL，并且通過電鏡觀察到腸球菌素與溶菌酶具有協(xié)同作用[42]。另外，研究發(fā)現pediocin PA1/AcH應用在肉制品中比Nisin能更好地抑制Listeriamonocytogenes生長，但不會干擾其他細菌的生長[43]。目前對細菌素的物理化學性質，以及在食品上的實際抗菌效果，都有了大量的研究；但除了Nisin，其他細菌素在目前食品工業(yè)中的應用還很少見。

5 食品中其他成分對細菌素抗菌效果的影響以及細菌素的包埋技術

5.1 食品中其他成分對細菌素抗菌效果的影響

細菌素具有很好的抗菌效果，但容易受到食品中某些成分的影響，導致在實際應用中的抗菌效果有限。比如在肉制品中，Nisin會與谷胱甘肽、脂肪等發(fā)生反應降低抑菌活性[44]。米酒乳桿菌素(sakacin)在吸附脂肪顆粒后會失活[45]。在牛奶中添加吐溫-80后，sakacin C2的抗大腸桿菌的活性也會降低[46]。除了食品中化學成分對細菌素有影響，靜電排斥和自我降解也會影響細菌素的抗菌活性[47]。對于影響細菌素抗菌效果的這些因素，包埋技術可以很好地解決。

5.2 細菌素的包埋技術

目前，細菌素的包埋材料采用最多的是殼聚糖，殼聚糖是一種天然多糖，在食品工業(yè)中廣泛用作抗菌劑。研究發(fā)現用殼聚糖包埋過后的Nisin比Nisin單獨作用的抑菌期限更長。ZIMET等[48]通過海藻酸鹽離子凝膠化和殼聚糖的絡合制備了負載Nisin的納米顆粒膠囊，顯著提高了Nisin在瘦牛肉中的抑菌活性。進一步通過殼聚糖—單甲基富馬酸制成納米顆粒搭載Nisin，這比Nisin單獨作用具有更好的抑菌活性和抗氧化能力，同時還可以抵抗不同種屬的微生物。另外，ALISHAHI等[49]通過實驗還發(fā)現殼聚糖納米顆粒負載可以大幅延長Nisin的抗菌作用。殼聚糖納米顆粒包埋增強Nisin的抗菌效果的機理很復雜。目前的研究發(fā)現，除了Nisin和殼聚糖本身的抗菌作用外，納米顆粒還會透過菌的細胞壁與DNA結合去抑制mRNA 和DNA的轉錄[50]。殼聚糖納米顆粒包埋Nisin后，電動電勢也顯著提高，這與抗菌效果也有很大關聯(lián)[51]。并且VUKOMANOVIA等[52]將Nisin結合到納米Au的表面后，發(fā)現Nisin有更加密集的正電荷，使得Nisin的抗菌效果顯著增強。包埋技術能夠增強Nisin的抗菌效果，這有助于擴展Nisin的應用范圍。但是包埋技術與Nisin結合的抗菌機制還未完全清楚，還有待進一步的研究。另外，包埋的技術成本高等因素也制約了其在實際中的應用，因此技術也有待進一步改善。

6 展望

細菌素作為天然、高效、無毒的生物防腐劑，對食品工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前只有Nisin應用在食品工業(yè)中，但Nisin的抑菌譜較窄，作用效果有限，不能完全滿足食品工業(yè)發(fā)展的需要。因此探索新型、抑菌譜廣的細菌素是下一步的主要研究方向。從分子水平上充分解析細菌素的抑菌機制，將有效促進細菌素在實際中的應用。包埋技術可以提高細菌素的抗菌效果，可以有效彌補現有細菌素抗菌譜窄、抗菌效果不穩(wěn)定等缺陷，低成本、高效抑菌的細菌素包埋技術研發(fā)也是未來的重要研究方向。