盛杰 古甫丁 古麗比克·木拉提 唐偉 馬良 米爾扎提·艾莎 地里下提·阿不力孜

作者單位：830049 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院骨科(盛杰、古甫丁、唐偉、馬良、米爾扎提·艾莎、地里下提·阿不力孜)，檢驗(yàn)科(古麗比克·木拉提)

耐藥結(jié)核病目前已成為我國(guó)結(jié)核病控制工作面臨的主要挑戰(zhàn)之一。骨關(guān)節(jié)結(jié)核作為最常見(jiàn)的肺外結(jié)核同樣面臨耐藥問(wèn)題。近年來(lái)，因耐藥導(dǎo)致結(jié)核病復(fù)發(fā)、手術(shù)失敗、因病致殘等不良后果屢見(jiàn)不鮮[1]。目前，結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)及表型藥物敏感性試驗(yàn)(drug susceptibility test，DST)作為診斷結(jié)核病及其耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的快速、準(zhǔn)確診斷并不理想[2]，臨床亟需能夠早期檢測(cè)耐藥骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷技術(shù)。WHO 先后推薦線性探針技術(shù)和GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)技術(shù)應(yīng)用于肺外結(jié)核病的診斷，但骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本獲取難度高，檢測(cè)結(jié)果受標(biāo)本來(lái)源、前處理過(guò)程影響較大，故兩種技術(shù)應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[3-4]。本研究采用GeneXpert技術(shù)及線性探針技術(shù)對(duì)同一組骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的病灶標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)比，以評(píng)價(jià)兩種分子生物學(xué)診斷技術(shù)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷及耐藥性檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選取新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院骨科2018年3—12月接受病灶清除手術(shù)或穿刺術(shù)的疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者172例作為研究對(duì)象。依據(jù)臨床綜合診斷標(biāo)準(zhǔn)[5](根據(jù)患者臨床癥狀、體征、影像學(xué)、病理學(xué)結(jié)果及抗結(jié)核藥物療效綜合判斷)確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者112例，其中脊柱結(jié)核76例，膝、髖等關(guān)節(jié)結(jié)核26例，恥骨、髂骨等部位結(jié)核10例；男46例，女66例；平均年齡(40.5±21.6)歲(年齡范圍4～83歲)。非骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者60例，其中布氏桿菌性脊柱炎、關(guān)節(jié)炎24例，化膿性膝關(guān)節(jié)炎、脊柱炎14例，骨性關(guān)節(jié)炎16例，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎4例，腕關(guān)節(jié)包蟲病2例；男38例，女22例；平均年齡(54.5±13.16)歲(年齡范圍37～75歲)。

二、研究方法

1.標(biāo)本采集及檢測(cè)：病灶清除手術(shù)或穿刺術(shù)中，取病灶組織標(biāo)本如膿液、肉芽組織、死骨等編號(hào)后進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)(經(jīng)患者知情同意后免費(fèi)檢測(cè))、線性探針檢測(cè)及MTB培養(yǎng)；同時(shí)對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性鑒定為MTB的分離菌株進(jìn)行DST檢測(cè)。

2.GeneXpert檢測(cè)：采用美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)的GeneXpert檢測(cè)試劑盒及GeneXpert全自動(dòng)檢測(cè)平臺(tái)，嚴(yán)格按照操作規(guī)程對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理后進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)及結(jié)果判定。

3.線性探針檢測(cè)：采用德國(guó)Hain Life Sciences公司的GenoType?MTBDR plus試劑盒，具體操作步驟參照試劑說(shuō)明。擴(kuò)增完成后將產(chǎn)物與探針試紙條進(jìn)行雜交，根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行是否耐藥的判讀。

4.MTB培養(yǎng)及DST檢測(cè)：采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)及配套試劑，依據(jù)說(shuō)明規(guī)范進(jìn)行菌種鑒定及DST檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以臨床綜合診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷參照標(biāo)準(zhǔn)，以BACTEC MGIT 960 DST結(jié)果為耐藥性檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各檢測(cè)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa正值越接近1代表一致性越好。同時(shí)，分別繪制兩種技術(shù)結(jié)核病診斷及利福平耐藥性的受試者工作特征曲線(簡(jiǎn)稱“ROC曲線”)，根據(jù)ROC曲線下的面積(AUC值)評(píng)價(jià)診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié) 果

一、骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷效能評(píng)價(jià)

以臨床綜合診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的效能。GeneXpert檢測(cè)敏感度和特異度分別為82.14%(92/112)和96.67%(58/60)，一致性良好(Kappa=0.74)。聯(lián)合檢驗(yàn)的敏感度和特異度分別為82.14%(92/112)和90.00%(54/60)，一致性良好(Kappa=0.68)。線性探針技術(shù)的敏感度和特異度分別為69.64%(78/112)和90.00%(54/60)，一致性一般(Kappa=0.54)。GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)的AUC值分別為0.89、0.80、0.86，診斷價(jià)值均較高(表1，圖1)。

二、MTB利福平耐藥性檢測(cè)效能評(píng)價(jià)

術(shù)中取患者病灶標(biāo)本送檢，GeneXpert技術(shù)可于2 h得出利福平耐藥結(jié)果：利福平耐藥20例；線性探針技術(shù)檢測(cè)可于24 h內(nèi)得出利福平耐藥結(jié)果：利福平耐藥21例；BACTEC MGIT 960 MTB培養(yǎng)于4周得出結(jié)果：112例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，MTB培養(yǎng)陽(yáng)性44例(39.29%)，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步行DST，檢出利福平耐藥18例；18例耐藥標(biāo)本中，12例為復(fù)治患者，6例為初治患者。

圖1 GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的ROC曲線

以BACTEC MGIT 960 DST結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為100.00%(18/18)和92.31%(24/26)，一致性較高(Kappa=0.91)，AUC值為0.96，提示診斷價(jià)值高；線性探針技術(shù)檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為100.00%(18/18)和88.46%(23/26)，一致性較高(Kappa=0.86)，AUC值為0.94。聯(lián)合檢驗(yàn)結(jié)果與線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，均低于GeneXpert，診斷價(jià)值較高(表2，圖2)。

表1 GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合以臨床綜合診斷為參照檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的效能

注敏感度=[真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))]×100%，特異度=[真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))]×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=[真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%]，陰性預(yù)測(cè)值=[真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%]

表2 GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合以BACTEC MGIT 960 DST為參照標(biāo)準(zhǔn)

注敏感度=[真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))]×100%，特異度=[真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))]×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=[真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%]，陰性預(yù)測(cè)值=[真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%]

圖2 GeneXpert、線性探針技術(shù)及兩種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的ROC曲線

討 論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者術(shù)前通常進(jìn)行至少2周抗結(jié)核藥物治療，加之早期病程隱匿、癥狀不典型，標(biāo)本不易采集，病灶含菌量少、分布不均勻，使得單純的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法檢測(cè)效能低，延誤診治。本研究結(jié)果中，112例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，MTB培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為39.29%，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致[6-7]。由于抗結(jié)核藥物治療對(duì)分子診斷技術(shù)影響較小，使其對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法更具優(yōu)勢(shì)。董偉杰等[3]對(duì)50例骨關(guān)節(jié)結(jié)核膿液標(biāo)本中MTB檢測(cè)結(jié)果顯示：MTB檢測(cè)陽(yáng)性率PCR檢測(cè)(48.0%)>BACTEC MGIT 960(40.0%)>羅氏培養(yǎng)(20.0%)。

本研究納入的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者主要以脊柱結(jié)核為主，同時(shí)包含其余常見(jiàn)病種，標(biāo)本選取膿液、肉芽組織、死骨等，基本覆蓋常見(jiàn)病變部位。結(jié)果顯示：在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核方面，GeneXpert技術(shù)的敏感度和特異度分別為82.14%和96.67%，與國(guó)內(nèi)近3年研究結(jié)果基本一致[7-8]；線性探針技術(shù)的敏感度和特異度分別為69.64% 和 90.00%，與Gu等[8]和梁瑞霞等[9]的研究結(jié)果基本一致。兩種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)的敏感度和特異度分別為82.14%和90.00%。三種檢測(cè)方法與臨床綜合診斷結(jié)果一致性良好，ROC曲線下面積提示診斷價(jià)值較好。上述研究結(jié)果說(shuō)明，GeneXpert技術(shù)和線性探針技術(shù)相較于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性較高，且極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，有助于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷。聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果一致性及ROC曲線下面積均優(yōu)于線性探針技術(shù)，能夠適當(dāng)?shù)谋苊饴┰\、誤診的發(fā)生。

值得注意的是，無(wú)論是本研究結(jié)果還是國(guó)內(nèi)外其他研究結(jié)果均顯示，GeneXpert與臨床綜合診斷結(jié)果的診斷價(jià)值高于線性探針技術(shù)，原因可能與GeneXpert檢測(cè)過(guò)程全自動(dòng)、全封閉，能夠有效解決標(biāo)本處理過(guò)程中的污染問(wèn)題，而線性探針技術(shù)則對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、基礎(chǔ)設(shè)施及操作人員水平要求較高，檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，單從技術(shù)層面考慮，GeneXpert便捷、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)使其更適宜在基層醫(yī)院推廣。此外，唐愷等[10]使用GeneXpert檢測(cè)膝關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度為69.00%，特異度為90.00%；Sam等[11]使用線性探針技術(shù)檢測(cè)椎體穿刺物的敏感度和特異度分別為83.3%和88.9%，檢測(cè)腰大肌膿腫膿液標(biāo)本的敏感度和特異度分別為50.0%和55.6%，說(shuō)明兩種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核不同病變部位的檢測(cè)效能存在差異。因此，臨床實(shí)際中應(yīng)注意標(biāo)本類型、標(biāo)本量的選取，并做好對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核不同標(biāo)本的預(yù)處理，盡可能減少誤差[12]。

本研究以BACTEC MGIT 960 DST結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為100.00%和92.31%，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致[8,13-14]；線性探針技術(shù)檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為100.00%和88.46%，聯(lián)合檢驗(yàn)結(jié)果與線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。兩種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)與BACTEC MGIT 960 DST結(jié)果一致性均較高，檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的效能較好，兩種技術(shù)單一檢測(cè)能夠滿足臨床對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)需求，從患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)方面考慮，聯(lián)合檢驗(yàn)在檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性方面臨床實(shí)用價(jià)值不大。

綜上所述，在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中，GeneXpert和線性探針技術(shù)在臨床治療中有較好的推廣價(jià)值。在MTB耐藥性檢測(cè)方面，建議結(jié)合患者癥狀、體征、經(jīng)濟(jì)水平等因素，在表型DST檢測(cè)的基礎(chǔ)上輔以分子DST檢測(cè)，有利于抗結(jié)核藥物治療方案的全面、快速制定。同時(shí)，本研究作為回顧性研究，存在一定局限性，且樣本例數(shù)較少，無(wú)法對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核不同發(fā)病部位及不同組織標(biāo)本的診斷差異進(jìn)一步研究。