張小萍 譚笑 易松林 陳振華 余艷艷 陳忠南 胡培磊 汪娟 尹曲華 譚云洪

作者單位：410013 長沙，湖南省胸科醫(yī)院 湖南省結(jié)核病防治所檢驗(yàn)科(張小萍、譚笑、易松林、陳振華、余艷艷、陳忠南、胡培磊、譚云洪)，內(nèi)四科(汪娟)，放射科(尹曲華)

近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室檢測能力和技術(shù)水平的提高，以及臨床醫(yī)師對非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)潛在致病性認(rèn)識的增強(qiáng)，NTM已報(bào)道的菌種越來越多，導(dǎo)致NTM感染呈明顯上升趨勢[1]。為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室對NTM檢測方法的認(rèn)識和鑒別能力，增進(jìn)臨床醫(yī)師對實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的正確認(rèn)知，現(xiàn)分享1例應(yīng)用真菌培養(yǎng)法檢出NTM的患者資料。

臨床資料

患者，男，54歲，職員。因“間斷咳嗽、咳痰、咯血6年，加重13 d”，于2017年11月16日入住湖南省胸科醫(yī)院?；颊?003年因肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)就診于廣州市胸科醫(yī)院，進(jìn)行規(guī)范抗結(jié)核藥物治療9個(gè)月后(2H-R-Z-E/H-R-E/6H-R)癥狀改善，無藥物不良反應(yīng)，遵醫(yī)囑停藥。其父40年前因PTB入院治療，出院后進(jìn)行規(guī)范抗結(jié)核藥物治療而治愈，無復(fù)發(fā)及再用藥史；余家族成員均體健。

圖1 為患者入院前(2017年11月5日)胸部CT掃描，可見雙肺各葉斑片、結(jié)節(jié)及索條狀影，病灶以右中葉及左下葉明顯，密度不均，邊界部分欠清；左下肺基底段可見少許磨玻璃樣影，雙肺各葉另可見多發(fā)小囊狀透亮區(qū)，右中葉支氣管狹窄，內(nèi)壁欠光滑圖2 為患者入院后(2017年11月21日)胸部CT掃描，可見右中葉及左下葉基底段斑片狀影較前吸收減少，密度變淡；余肺各葉仍可見散在斑片、結(jié)節(jié)及索條狀影；無明顯新發(fā)病灶

患者6年前受涼后出現(xiàn)劇烈、陣發(fā)、刺激性咳嗽，咳少許白色黏痰，咯大量鮮紅色血痰(1次約400～500 ml)，伴頭暈、心悸、午后低熱等不適，就診于當(dāng)?shù)乜h人民醫(yī)院；結(jié)合既往病史并完善相關(guān)檢查后提示肺部病變，擬診為PTB。轉(zhuǎn)診至當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心予以抗結(jié)核、護(hù)肝等藥物治療?；颊哂盟幒蟀Y狀改善，無藥物不良反應(yīng)，但病情反復(fù)、遷延不愈，仍有間斷咳嗽、咳痰、咯血，分別于2012年采用3H-R-E/8H-R方案、2013年采用7H-R、2014年采用9H-R治療，每年均遵醫(yī)囑停用藥物。2016年患者再次因上述癥狀加重而就診于當(dāng)?shù)乜h人民醫(yī)院，進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療9個(gè)月(9H-R)后癥狀改善而自行停藥。

2017年11月3日患者受涼后出現(xiàn)咳嗽、咳痰，伴有咯大量鮮紅色血(1次約400 ml)，就診于當(dāng)?shù)乜h人民醫(yī)院。11月 5日胸部CT掃描，可見雙肺各葉斑片、結(jié)節(jié)及索條狀影，病灶以右中葉及左下葉明顯，密度不均，邊界部分欠清；左下肺基底段可見少許磨玻璃樣影，雙肺各葉另可見多發(fā)小囊狀透亮區(qū)，右中葉支氣管狹窄、內(nèi)壁欠光滑(圖 1)。予以抗感染、止咳、化痰及止血等對癥治療(具體藥物不詳)13 d后，患者咳嗽、咳痰較前好轉(zhuǎn)，但自覺治療效果欠佳，為求進(jìn)一步治療于2017年11月16日入住我院。

患者入院時(shí)體溫36.9 ℃，脈搏96次/min，呼吸頻率20次/min，血壓138/80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。急性病容，神志清楚，雙肺呼吸音粗，可聞及少許濕性啰音。余未見異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、血紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、肝腎功能等基本正常。其他相關(guān)檢查(入院48 h)：HBsAg (+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)；3次痰標(biāo)本(晨痰、夜間痰、即時(shí)痰，規(guī)范留取)經(jīng)分枝桿菌涂片抗酸染色、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960”)、羅氏培養(yǎng)、血清結(jié)核抗體、結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))、分子生物學(xué)檢測(如GeneType MTBDRplus)，以及全血γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)等結(jié)核病相關(guān)檢查均為陰性。結(jié)合既往結(jié)核病病史和11月5日外院胸部CT掃描表現(xiàn)，初步診斷為雙肺感染、右上中及左上葉多發(fā)空洞并輕度支氣管擴(kuò)張、右中葉支氣管狹窄，左下肺肺泡積血，不除外PTB。予以口服薄芝糖肽增強(qiáng)免疫力、口服細(xì)辛腦化痰、靜脈滴注頭孢地嗪注射液行診斷性抗感染治療。

11月18日組織放射科會診，修正診斷為繼發(fā)性涂陰復(fù)治PTB(右肺上中下、左肺上下)并發(fā)肺部感染。加服吡嗪酰胺片(Z，0.75 g/次，3次/d)及左氧氟沙星(Lfx，0.6 g/次，3次/d)行診斷性抗結(jié)核藥物治療及復(fù)方二氯醋酸二異丙胺護(hù)肝治療。11月21日患者癥狀好轉(zhuǎn)，但仍有陣發(fā)性咳嗽、咳少許白色痰。胸部CT復(fù)查，可見左下葉基底段斑片狀影較前明顯減少，密度變淡，余肺各葉病灶同前，無明顯新發(fā)病灶(圖2)，提示診斷性抗感染治療有效，而診斷性抗結(jié)核藥物治療僅3 d，難以評估療效；為排除肺部腫瘤，于11月23日行痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查，可見較多上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，抗酸染色陽性(+)，修正診斷為涂陽復(fù)治繼發(fā)性肺結(jié)核(右肺上中下、左肺上下)?；诨颊呃^往長期不規(guī)范H、R用藥史，不排除耐藥可能，但在無藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果的情況下，考慮患者來我院前已停用H-R治療3個(gè)月，予以當(dāng)前抗結(jié)核治療方案加服H(0.30 g/次，1次/d)及靜脈滴注阿米卡星(Am，0.40 g/次，1次/d)、對氨基水楊酸鈉(PAS，12.0 g/次，1次/d)。

11月27日，支氣管鏡檢查可見1～3級支氣管黏膜輕度發(fā)紅，有少許黏稠分泌物(圖3～5)。同時(shí)取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標(biāo)本行抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF、MGIT 960、羅氏培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)(沙氏培養(yǎng)基)等病原學(xué)相關(guān)檢查，除沙氏培養(yǎng)基5 d 后有較多單一菌落生長(“+”～“++”)(圖6)外，其他檢測結(jié)果均為陰性。12月2日患者咳嗽、咳痰較前好轉(zhuǎn)，肺部濕性啰音消失，停用頭孢地嗪。

12月4日，取沙氏培養(yǎng)基可疑菌落行革蘭染色(圖7)、抗酸染色(圖8)，結(jié)合菌落生長特點(diǎn)考慮菌落為快生長NTM。因羅氏培養(yǎng)陰性，且以往未見沙氏培養(yǎng)基檢出NTM的報(bào)道，擔(dān)心為污染菌導(dǎo)致誤報(bào)，為避免對疑似NTM肺病患者進(jìn)行錯(cuò)誤的試驗(yàn)性治療[2]，于12月6日提取該可疑菌落DNA，對基因片段hsp65、ITS進(jìn)行測序鑒定。

12月8日，患者仍有陣發(fā)性咳嗽、咳少許白色痰；異煙肼血藥濃度監(jiān)測正常；加服乙胺丁醇(E，0.75 g/次，1次/d)行抗結(jié)核治療。12月15日胸部CT復(fù)查，可見雙肺結(jié)核病灶好轉(zhuǎn)，但左下葉前內(nèi)基底段新見斑片狀增高密度影(圖9)，考慮結(jié)核播散灶或炎性感染，加用頭孢地嗪抗感染治療，于12月22日患者癥狀好轉(zhuǎn)后停用。12月17日再次行痰標(biāo)本(晨痰，規(guī)范留取)抗酸染色檢查，為陽性(+++)；12月18日痰標(biāo)本行MGIT 960培養(yǎng)，結(jié)果陽性，結(jié)核分枝桿菌抗原檢測， MPB64分泌蛋白陰性，疑似NTM生長，不排除結(jié)核分枝桿菌；考慮到沙氏培養(yǎng)與MGIT 960的結(jié)果只是初步培養(yǎng)，不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和NTM，分枝桿菌的菌種鑒定需依賴于進(jìn)一步的生化反應(yīng)試驗(yàn)，即通過分枝桿菌接種于中性羅氏、PNB、TCH培養(yǎng)基，根據(jù)三種培養(yǎng)基上的菌落生長情況(是否生長)，可以區(qū)分NTM、人型結(jié)核分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌等，故同日將MGIT陽性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于以上3種鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步菌種鑒定。12月20日沙氏培養(yǎng)基可疑菌落采用Sanger基因測序技術(shù)，結(jié)果回報(bào)為膿腫分枝桿菌；12月29日結(jié)合中性羅氏、PNB、TCH三種鑒別培養(yǎng)基菌落生長特點(diǎn)的結(jié)果(圖10)及抗酸染色、革蘭染色結(jié)果，報(bào)告為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌及污染菌。2018年1月10日MGIT 960陽性培養(yǎng)物經(jīng)Sanger測序?yàn)槟撃[分枝桿菌，與沙氏培養(yǎng)基可疑菌落菌種鑒定結(jié)果一致，可排除污染菌所致。

表1 三種培養(yǎng)方法對菌種鑒定結(jié)果的關(guān)系

注TCH為噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基，PNB為對硝基苯甲酸培養(yǎng)基；“+”為有菌落生長，“-”為無菌落生長

1月11日，結(jié)合患者臨床癥狀、胸部CT掃描、基因測序結(jié)果，修改診斷為肺結(jié)核并發(fā)膿腫分枝桿菌感染，調(diào)整治療方案[2]，加服克拉霉素(Cr,0.25 g/次，1次/d)聯(lián)合頭孢西丁抗NTM治療13 d后，患者癥狀逐漸好轉(zhuǎn)于1月24日出院。出院帶藥情況： 口服H，0.30 g/次，1次/d；E，0.75 g/次，1次/d；Z，0.75 g/次，2次/d；金蕎麥片，1.32 g/次，3次/d；雙環(huán)醇，0.05 g/次，3次/d；克拉霉素(Cr),0.25 g/次，2次/d；靜脈滴注Am，0.40 g/次，1次/d(自備)和PAS，12.0 g/次，1次/d(自備)。4月19日胸部CT復(fù)查可見病灶好轉(zhuǎn)，左下葉前內(nèi)基底段新見的斑片狀增高密度影較前明顯吸收減少，密度變淡(圖11)。7月中旬隨訪，患者病情穩(wěn)定，無反復(fù)現(xiàn)象，已正常生活工作，同時(shí)遵醫(yī)囑徹底停藥進(jìn)一步說明肺結(jié)核并發(fā)膿腫分枝桿菌感染診斷明確，抗NTM和抗結(jié)核藥物治療方案有效。

圖3～5 為2017年11月27日隆突、左上葉及右上葉電子支氣管鏡檢查：未見會厭、氣管、隆突明顯異常；1～3級支氣管黏膜輕度發(fā)紅，表面光滑，有少許黏稠分泌物，引流通暢，未見腫瘤及活動(dòng)性出血 圖6～8 2017年12月4日BALF標(biāo)本在28 ℃條件下真菌培養(yǎng)(沙氏培養(yǎng)基)及菌落革蘭、抗酸染色結(jié)果。圖6為真菌培養(yǎng)第7天時(shí)可見直徑2～3 mm、呈乳白色、車輪狀或放射狀粗糙的菌落生長，大部分菌落表面干燥有皺褶。圖7為革蘭染色( ×100)，鏡下可見革蘭陽性桿菌，部分著色不均，形態(tài)不規(guī)則，呈分枝。圖8為抗酸染色( ×100)，鏡下可見抗酸陽性桿菌，形態(tài)不規(guī)則，部分有分枝 圖9 患者2017年12月15日胸部CT掃描，可見雙肺各葉斑片、結(jié)點(diǎn)狀影部分稍吸收減少，邊緣變清晰，多發(fā)小囊狀透亮區(qū)部分稍減縮小、閉合，部分稍排空，左下葉前內(nèi)基底段新見斑片狀密度增高影；雙下肺新增少許結(jié)點(diǎn)狀影圖10 可疑陽性菌株在28 ℃條件下，中性羅氏、TCH、PNB培養(yǎng)基(從左至右)培養(yǎng)第7天時(shí)生長的菌落，3種培養(yǎng)基均可見粗糙、大小不一、淡黃色或黃色菌落，其中中性羅氏培養(yǎng)基菌落生長較少較大，其次為TCH、PNB培養(yǎng)基菌落生長較多較小 圖11 2018年4月19日胸部CT復(fù)查，可見雙肺各葉斑片狀影部分吸收減少，邊緣部分變清晰，多發(fā)小囊狀透亮區(qū)部分壁變?。蛔笙氯~前內(nèi)基底段新見的斑片狀密度增高影較前明顯吸收減少，密度變淡

討 論

NTM是一種毒力低于結(jié)核分枝桿菌的條件致病菌，可經(jīng)呼吸道、消化道或破損皮膚等入侵，或在人體呼吸道(如鼻竇、咽部等)非無菌部位定植[3-4]，極易導(dǎo)致免疫力低下患者感染NTM，如免疫功能缺陷或受損者(干細(xì)胞或器官移植、惡性腫瘤、HIV感染、長期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等)[2,5]，以及存在肺部基礎(chǔ)疾病者(如PTB、COPD、塵肺等)[6]，成為難治性感染性疾病，常見于肺部感染[7]。

NTM肺病臨床癥狀與PTB相似，常見咳嗽、咳痰、咯血、低熱等癥狀[2,8]；胸部影像學(xué)表現(xiàn)為斑片、結(jié)節(jié)狀影及空洞、支氣管擴(kuò)張等特點(diǎn)[2]，也與PTB相同；病原菌革蘭染色、抗酸染色涂片鏡檢均為陽性，與PTB一致；故僅僅依靠以上臨床表現(xiàn)難以區(qū)分NTM肺病與PTB，在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，NTM肺病有可能長期被誤診為PTB[9-10]。本例患者6年來多次規(guī)范服用抗結(jié)核藥物，但臨床癥狀遷延不愈或病情反復(fù)，不能排除患者為PTB并發(fā)NTM肺病或NTM肺病長期被誤診為PTB的可能。本例患者入院時(shí)，因臨床癥狀和胸部CT表現(xiàn)與PTB無明顯差異，且既往有長期PTB治療史、抗結(jié)核治療部分有效，導(dǎo)致臨床醫(yī)師對肺結(jié)核患者可能并發(fā)NTM感染的忽視，可能使該患者長期漏診NTM感染，僅就肺部感染、PTB復(fù)發(fā)，結(jié)合用藥史、結(jié)核分枝桿菌耐藥穩(wěn)定性特點(diǎn)進(jìn)行治療[11-12]。雖然患者入院48 h內(nèi)痰標(biāo)本分枝桿菌相關(guān)檢查均表現(xiàn)為陰性，但不能排除該患者為PTB并發(fā)NTM感染。治療5 d后胸部CT復(fù)查示肺部病灶減輕，提示抗感染治療有效；治療10 d后，行電子支氣管鏡影像檢查所見說明存在肺部感染或炎癥；同時(shí)BALF標(biāo)本真菌培養(yǎng)(沙氏培養(yǎng)基)出現(xiàn)疑似條件致病菌生長，結(jié)合菌落生長特點(diǎn)、革蘭、抗酸染色結(jié)果，考慮菌落為快生長分枝桿菌。盡管筆者此時(shí)高度懷疑患者存在NTM感染，但因羅氏培養(yǎng)等為陰性、以往未見沙氏培養(yǎng)基檢出NTM的報(bào)道，擔(dān)心為污染菌誤報(bào)；而且考慮NTM對臨床常用抗生素及抗結(jié)核藥物普遍存在耐藥[2,13]，不同菌種對藥物敏感性也不相同，故筆者對沙氏培養(yǎng)基陽性培養(yǎng)物進(jìn)行了菌種鑒定[14]，結(jié)果為膿腫分枝桿菌(屬于NTM中的一類快生長分枝桿菌，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，快生長分枝桿菌在3～5 d內(nèi)即肉眼可見菌落生長，多數(shù)在7 d內(nèi)生長旺盛[2])，說明真菌培養(yǎng)法可培養(yǎng)出膿腫分枝桿菌，對于是否可以培養(yǎng)出其他NTM還需要進(jìn)一步研究。

頭孢地嗪屬第三代頭孢菌素類廣譜抗菌藥物，對多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，主要對多種革蘭陽性菌(G+)、革蘭陰性菌(G-)及厭氧菌有效。頭孢西丁是一種頭霉素類衍生物，頭孢西丁鈉對G+菌、G-菌和淋球菌、部分厭氧菌有較強(qiáng)的抗菌作用，也是抗NTM推薦用藥[2]。本報(bào)告患者在我院使用頭孢地嗪抗感染治療2周癥狀好轉(zhuǎn)后停用，于12月8日加用乙胺丁醇加強(qiáng)抗結(jié)核治療至1周后行胸部CT復(fù)查，可見雙肺病灶部分好轉(zhuǎn)，但出現(xiàn)新增少許病灶；提示患者病情反復(fù)或加重，或并發(fā)其他非普通菌感染，或?qū)σ野范〈寄退?；?2月15日再次加用頭孢地嗪抗感染治療1周后患者癥狀又出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，說明頭孢地嗪對膿腫分枝桿菌治療有一定療效。復(fù)查痰標(biāo)本，MGIT 960培養(yǎng)陽性物經(jīng)基因測序?yàn)槟撃[分枝桿菌，不僅證實(shí)了真菌培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出膿腫分枝桿菌，而且也明確了該患者為肺結(jié)核并發(fā)膿腫分枝桿菌肺病的診斷。根據(jù)專家共識推薦膿腫分枝桿菌肺病的治療方案，采用1種大環(huán)內(nèi)酯類藥物如Cr或阿奇霉素，聯(lián)合1種或多種靜脈用藥物，如Am、頭孢西丁或伊米配能，療程6個(gè)月[2]。本報(bào)告患者在加用Cr聯(lián)合頭孢西丁等治療后癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，病情穩(wěn)定，無反復(fù)現(xiàn)象，說明Cr和頭孢西丁對膿腫分枝桿菌有較好療效。

綜上所述，真菌培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出膿腫分枝桿菌，微生物實(shí)驗(yàn)室在使用真菌培養(yǎng)法進(jìn)行標(biāo)本檢測時(shí)，如發(fā)現(xiàn)可疑陽性菌株，應(yīng)及時(shí)涂片行革蘭、抗酸等染色，警惕是否為NTM感染。NTM肺病與PTB在臨床癥狀、影像學(xué)改變、顯微鏡檢查(革蘭、抗酸染色均陽性)上極為相似，臨床醫(yī)生應(yīng)提高對NTM肺病的認(rèn)識，對于疑似或確診的PTB患者，在標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核藥物治療過程中，如患者臨床癥狀不緩解或病情反復(fù)、遷延不愈，需反復(fù)多次完善痰分枝桿菌培養(yǎng)，并重視追蹤其培養(yǎng)結(jié)果，警惕并發(fā)NTM感染。真菌培養(yǎng)法觀察間隔時(shí)間一般為2或4 d至5或7 d，短于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法(一般為3、7、14 d，直至56 d)，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)疑似致病菌生長、縮短檢出快生長型NTM的時(shí)間。因此，應(yīng)用真菌培養(yǎng)法檢測少見的生長慢于48 h的病原菌方法值得推廣。