高漫 白廣紅 周祎 王卓

作者單位：710100 西安，陜西省結(jié)核病防治院

結(jié)核性腦膜炎在結(jié)核病患者中約占1%，但是病死率極高[1-2]。早期診斷及盡早治療是降低結(jié)核性腦膜炎病死率和致殘率的關(guān)鍵所在。目前，公認(rèn)分子生物學(xué)方法具有敏感、快速、特異、高效等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于結(jié)核性腦膜炎的快速診斷。本研究探討了結(jié)核分枝桿菌BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)、RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)(SAT-TB技術(shù))、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-熒光探針檢測技術(shù)(簡稱“PCR技術(shù)”)、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”技術(shù))4種檢測方法對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值，以期為提高結(jié)核性腦膜炎的早期診斷提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

1. 研究對(duì)象的選擇：搜集陜西省結(jié)核病防治院2015年5月至2017年5月期間519例疑似結(jié)核性腦膜炎住院患者作為研究對(duì)象，其中男336例，女183例，年齡9～79歲，平均年齡(43.97±17.58)歲。以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對(duì)照，519例患者標(biāo)本同時(shí)采用結(jié)核分枝桿菌MGIT 960培養(yǎng)和SAT-TB、PCR技術(shù)、GeneXpert技術(shù)進(jìn)行檢測。

2. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[3]的診斷方法，354例患者被診斷為結(jié)核性腦膜炎，其余165例排除結(jié)核性胸膜炎的診斷。165例患者最終根據(jù)臨床用藥治愈的結(jié)果診斷為化膿性腦膜炎102例、病毒性腦膜炎59例、新型隱球菌性腦膜炎4例。

3. 知情同意：本研究通過本院倫理委員會(huì)審核，獲得所有患者知情同意。

二、試劑與儀器

MGIT 960系統(tǒng)及培養(yǎng)管、試劑盒由美國BD公司生產(chǎn)；SAT-TB檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司生產(chǎn)，擴(kuò)增儀為上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的9GP型PCR擴(kuò)增儀。晶芯?分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR檢測試劑盒)由博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，擴(kuò)增儀為上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的9GP型PCR擴(kuò)增儀。GeneXpert儀器及試劑盒由美國Cepheid公司研發(fā)生產(chǎn)。

三、方法

1. MGIT 960培養(yǎng)：取3 ml腦脊液標(biāo)本于無菌離心試管中以3000×g離心15 min富集，培養(yǎng)管中加入0.8 ml營養(yǎng)添加劑與雜菌抑制劑混合物；取0.5 ml樣本沉淀接種至MGIT培養(yǎng)管上機(jī)培養(yǎng)。若培養(yǎng)陽性，約15 d報(bào)告陽性結(jié)果，培養(yǎng)42 d后若未報(bào)告陽性則判斷為陰性[4]。

2. SAT-TB技術(shù)：取1 ml腦脊液置于1.5 ml離心管中，3500×g離心5 min，棄上清；加無菌生理鹽水振蕩混勻，3500×g離心5 min，棄上清；加入50 μl稀釋液，混勻；將陰性和陽性對(duì)照樣品和準(zhǔn)備好的樣本放入功率200 W的超聲破碎儀中進(jìn)行超聲破碎15 min。微量反應(yīng)管中每管加擴(kuò)增檢測液30 μl，再加入破碎好的樣本2 μl，放入干熱恒溫儀，加熱至60 ℃持續(xù)10 min，42 ℃持續(xù)5 min，之后保持在42 ℃的溫度下加入MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7聚合酶的混合酶液；最后通過9GP型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，然后判讀結(jié)果。

3. PCR檢測：取1 ml腦脊液至1.5 ml離心管中，3500×g離心5 min，棄上清；加入1 ml洗液離心，棄上清，吸干剩余的液體，注意不要碰到或吸走沉淀；提取核酸；將核酸提取管置于95 ℃金屬浴5 min后，取出核酸提取管，3500×g離心1 min后備用；加2 μl模板DNA或?qū)φ掌分翑U(kuò)增反應(yīng)液管中；PCR擴(kuò)增，判讀結(jié)果。

4. GeneXpert技術(shù)：取3 ml腦脊液以3000×g離心15 min 后富集，留取1 ml沉淀；加入1 ml樣本處理液混勻15 min，然后將2 ml樣品混合物加入到GeneXpert檢測匣中，按照生產(chǎn)商使用說明，將檢測匣裝載到GeneXpert儀器中，上機(jī)，自動(dòng)判讀結(jié)果。

5. 研究內(nèi)容：對(duì)MGIT 960培養(yǎng)和SAT-TB、PCR、GeneXpert 技術(shù)檢測的診斷效能進(jìn)行比較，探討各檢測技術(shù)診斷結(jié)核性腦膜炎的價(jià)值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較4種檢驗(yàn)方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值及其95%CI值。

結(jié) 果

519例研究對(duì)象中，臨床腦脊液標(biāo)本應(yīng)用MGIT 960培養(yǎng)、SAT-TB技術(shù)、PCR技術(shù)、GeneXpert技術(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert技術(shù)檢測結(jié)核病的敏感度高于MGIT 960培養(yǎng)、SAT-TB技術(shù)和PCR技術(shù)。MGIT 960培養(yǎng)檢測結(jié)核病的敏感度高于SAT-TB和PCR技術(shù)。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)4種技術(shù)檢測結(jié)核性腦膜炎的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；“-”表示不存在相關(guān)數(shù)據(jù)

討 論

目前，結(jié)核性腦膜炎的診斷需依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、神經(jīng)影像學(xué)特點(diǎn)、腦脊液改變和對(duì)抗結(jié)核藥物治療有效進(jìn)行綜合判定，明確診斷的主要依據(jù)為腦脊液細(xì)胞涂片或細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌[5]；而在細(xì)菌學(xué)診斷中，涂片抗酸染色和培養(yǎng)法一直是大家熟知的方法，但是由于涂片陽性檢出率極低，培養(yǎng)周期長，免疫學(xué)方法中結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、既往感染及宿主全身免疫狀態(tài)等干擾因素，假陽性率和假陰性率都較高[6]，影響結(jié)核性腦膜炎患者的早期診斷和治療。所以快速、簡便、敏感度和特異度高的診斷方法對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷尤為重要。

MGIT 960培養(yǎng)及菌種鑒定為結(jié)核病診斷的標(biāo)準(zhǔn)[7]，還能進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)；在本研究中該技術(shù)檢測的敏感度為23.7%，高于SAT-TB和PCR技術(shù)，仍是不可缺少的方法；但其操作繁瑣，培養(yǎng)周期長，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，操作過程中對(duì)操作人員及環(huán)境有較大威脅。SAT-TB技術(shù)的操作簡單，2 h內(nèi)可獲得檢測結(jié)果[8]，對(duì)于生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍，是一個(gè)較好的預(yù)后指標(biāo)[9]；在本研究中的敏感度為7.6%，較文獻(xiàn)報(bào)道的直接涂片法檢測的敏感度(2.53%[10])高，還可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌有無生命力且實(shí)驗(yàn)過程中交叉污染較少，可為結(jié)核病患者的治療效果提供參考；但是該技術(shù)檢測敏感度仍舊較低[11]，由于細(xì)菌體內(nèi)RNA的存在與病原體生命力有關(guān)，當(dāng)病原體無生物活性時(shí)，RNA裂解，檢測不出結(jié)果，敏感度低于DNA檢測。PCR技術(shù)操作簡單，3 h內(nèi)可獲得檢測結(jié)果，根據(jù)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量及變化趨勢可用于判斷療效，MTB-DNA拷貝數(shù)下降說明對(duì)該藥物治療有效[12]；但是其陽性標(biāo)本不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌是否存在生命力。GeneXpert技術(shù)將MGIT 960培養(yǎng)至少需要3周才能完成的結(jié)核分枝桿菌檢測及其對(duì)利福平是否耐藥的檢測時(shí)間縮短為2 h[13]，敏感度較本研究中其他3種方法更高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且GeneXpert技術(shù)操作簡單，工作人員比較容易學(xué)會(huì)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)手動(dòng)操作時(shí)間不超過5 min，并且檢測結(jié)果不會(huì)因人而異，整個(gè)檢測在一個(gè)密閉環(huán)境中進(jìn)行，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和工作人員有較好的保護(hù)[14]。WHO亦推薦GeneXpert技術(shù)替代涂片、培養(yǎng)等技術(shù)，用于肺外結(jié)核的快速診斷。對(duì)于基層工作人員來說，該儀器對(duì)操作人員、環(huán)境要求低，較容易開展，對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷具有較高的價(jià)值。GeneXpert技術(shù)通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)檢測時(shí)探針循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)的大小結(jié)果，可作為半定量評(píng)價(jià)指標(biāo)指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)后判斷等。