孟卓玲 曹玉潔 單丹丹 方春 繆小菲 費月新方柄杰 王越 趙文佳 侯璐燕 吳敏 吳洪愷

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，杭州311300；#共同第一作者；*通訊作者：hongkaiwu＠163．com）

水稻是我國的主要糧食作物，世界上一半以上的人口以稻米為主食。水稻也是主要糧食作物中基因組較小的作物。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，水稻作為模式生物，一方面，大規(guī)模創(chuàng)造突變體庫；另一方面，構(gòu)建遺傳分析群體，開展了廣泛的分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究。

性狀遺傳分析的基本方法是，一對相對性狀雜交構(gòu)建分離群體，根據(jù)目標(biāo)性狀在分離群體中的表現(xiàn)，推斷目標(biāo)性狀的遺傳特征。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，重要農(nóng)藝性狀基因或QTL（Quantitative Trait Locus）的定位和克隆成為遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，遺傳分析群體同時又作為基因定位群體。最常用的群體有F2群體和回交F1群體，這類群體構(gòu)建簡單，工作量小，時間短，但目標(biāo)性狀檢測只能以單株（個體）進行，每種基因型僅由1個單株（個體）提供表型值，對于受環(huán)境影響較大的性狀，如產(chǎn)量，性狀值度量可靠性差。F2∶3群體，即用F2群體中1個個體衍生的F3群體（一般10～30個個體）的平均值代表1個F2個體的表型值，可以減小性狀值度量的誤差[1]。但與F2群體和回交F1群體一樣，個體中有雜合基因型，不能設(shè)置重復(fù)來估計或減小誤差。重組自交系群體（Recombination Inbred Lines,RIL）和加倍單倍體群體（Double Haploids,DH），這類群體的各個株系的基因型都是純合的，可以多年多點種植，通過設(shè)置重復(fù)來減小或估計誤差，提高了目標(biāo)性狀鑒定的準(zhǔn)確性。但這類群體的遺傳背景復(fù)雜，個體間遺傳差異大，對復(fù)雜的遺傳性狀來說，“遺傳噪音”大，基因定位的準(zhǔn)確性低。

Paterson等[2－3]提出了構(gòu)建染色體片段代換系（Chromosome segment substitution lines,CSSLs）用于基因精細(xì)定位和圖位克隆研究。CSSLs每個系與受體親本的遺傳差異僅限于某一染色體的代換片段，它們的表型差異只是由該代換片段的差異所引起，能有效地消除遺傳背景的干擾。CSSLs可以提高復(fù)雜農(nóng)藝性狀基因定位的精確性，尤其是遺傳效應(yīng)較小的數(shù)量性狀基因。在初步定位的基礎(chǔ)上，含有目標(biāo)QTL的染色體片段代換系與受體親本雜交，建立次級分離群體，使QTL定位分析錨定在很窄的染色體片段上，進一步消除遺傳背景的干擾，從遺傳上和統(tǒng)計上提高了QTL定位和效應(yīng)估計的準(zhǔn)確性。日本水稻基因組研究計劃Yano研究組構(gòu)建了以Nipponbare為遺傳背景的Kasalath全基因組染色體片段代換系，并將水稻抽穗期QTLHd-1、Hd-2、Hd-6和Hd-8分別分解為單個孟德爾因子，將Hd-3分解為2個單基因Hd-3a和Hd-3b，且精細(xì)定位了Hd-1、Hd-2、Hd-3a、Hd-3b、Hd-6和Hd-8等 6 個基因[4－5]；在此基礎(chǔ)上，圖位克隆了Hd-1、Hd-3a和Hd-6[6－8]。日本九州大學(xué)Yoshimura研究組構(gòu)建了分別以Asominori和IR24互為遺傳背景的兩套全基因組CSSLs[9－10]和一套以Taichung65為遺傳背景的非洲稻全基因組CSSLs[3]。Doi等[11]利用該CSSLs將第10染色體上抽穗期主效QTL分解為單基因Ehd1，并成功進行了圖位克隆。

圖1 秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分子標(biāo)記連鎖圖譜

以上這些研究成果和染色體片段代換系在有利基因發(fā)掘方面的優(yōu)越性，極大地鼓舞了國內(nèi)研究者開展構(gòu)建染色體片段代換系的構(gòu)建工作[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

秀水134，浙江省推廣面積最大的晚粳稻品種，作為背景親本；揚稻6號，超級稻親本，為供體親本。

1.2 方法

1.2.1 多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選和連鎖圖譜的構(gòu)建

根據(jù)McCouch構(gòu)建的分子標(biāo)記連鎖圖譜[14]，選擇分子標(biāo)記進行秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分析；用Mapchart 2.2繪制多態(tài)性SSR標(biāo)記連鎖圖。

1.2.2 染色體片段代換系構(gòu)建

分3步進行：

第1步，親本秀水134和揚稻6號雜交并自交獲得F2群體；從F2群體中隨機選擇單株與秀水134回交，獲得BC1F1群體；BC1F1群體中隨機選單株與秀水134回交，獲得BC2F1群體；對BC2F1群體進行分子標(biāo)記基因型鑒定，根據(jù)分子標(biāo)記基因型，選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的單株，初步構(gòu)建覆蓋全基因組的代換系（雜合型）。

圖2 以秀水134為輪回親本和揚稻6號構(gòu)建染色體片段代換系（雜合型）

第2步，每個代換系繼續(xù)與秀水134回交，得到BC3F1群體，進行分子標(biāo)記基因型鑒定，根據(jù)分子標(biāo)記基因型，選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的單株，構(gòu)建覆蓋全基因組的代換系（雜合型）。

第3步，BC3F1群體自交，在后代群體中進行分子標(biāo)記基因型鑒定。選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的純合單株，組成覆蓋全基因組的代換系（純合型）。

1.2.3 代換片段長度的計算

按Young等[15]的方法計算代換片段的長度，不考慮2個相鄰分子標(biāo)記間發(fā)生雙交換事件。當(dāng)相鄰標(biāo)記的基因型和供體親本的基因型相同時，認(rèn)為這2個分子標(biāo)記覆蓋的染色體區(qū)段為供體的代換片段；當(dāng)相鄰標(biāo)記基因型分別和供體親本、受體親本相同時，認(rèn)為這2個標(biāo)記之間的中點為該代換片段的邊界點，兩端邊界點之間的距離就是該代換片段的長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建

根據(jù)McCouch等[14]構(gòu)建的分子標(biāo)記連鎖圖譜，從中選擇了629對引物，進行秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分析，篩選到兩個親本間有多態(tài)的引物263對，親本間多態(tài)性比例為41.8%。選擇PCR擴增條帶分辨清晰，且均勻覆蓋水稻12條染色體的95對多態(tài)性分子標(biāo)記，用Mapchart2.2繪制多態(tài)性SSR標(biāo)記連鎖圖（圖1），全基因組總長度為1 499.6 cM。

2.2 染色體片段代換系的構(gòu)建

分3步進行：

第1步，親本秀水134和揚稻6號雜交并自交獲得F2群體；從F2群體中隨機選擇97個單株與秀水134回交，獲得BC1F1群體，共97個株系；BC1F1群體每個株系種植10株，隨機選1株與秀水134回交，獲得BC2F1群體，共97個株系；BC2F1群體中每個株系隨機選3株進行分子標(biāo)記基因型鑒定，根據(jù)分子標(biāo)記基因型，選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的單株，篩選了53株（另24個單株作為備份），初步構(gòu)建覆蓋全基因組的代換系（雜合型），見圖2。

第2步，每個代換系繼續(xù)與秀水134回交，得到BC3F1群體，共53個系，1 350株。對1 350株進行分子標(biāo)記基因型鑒定，根據(jù)分子標(biāo)記基因型，選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的單株，篩選了198株，構(gòu)建覆蓋全基因組的代換系（雜合型），原理同第一步，圖略。

1代表揚稻6號基因型，2代表雜合型，3代表秀水134基因型。

圖4 圖示染色體代換系構(gòu)建流程

第3步，198株（雜合型）自交，得198個株系，每個株系種植21～24株，共取樣4 086株，進行分子標(biāo)記基因型鑒定。選擇代換片段盡量少、目的片段盡量長的純合單株，組成覆蓋全基因組的代換系（純合型），見圖3。

以上3步的具體流程圖示為圖4。

2.3 染色體片段代換系的構(gòu)建質(zhì)量評價

對染色體片段代換系的53個株系的代換片段長度進行分析，代換片段最大的為7X5號株系，為182．15cM，占全基因組的 12．15%；代換片段最短的為7X29 號株系，為 7．4cM，占全基因組的 0．49%，見圖 5。該套染色體片段代換系代換片段總長度平均值75．30cM，占全基因組 5．00%。

12條染色體代換片段覆蓋總長度為1 995 cM，覆蓋水稻全基因組的1．33倍（表1）。其中，4號染色體的代換片段覆蓋總長度最長，為212．7cM，覆蓋4號染色體基因組的1．66倍；12號染色體代換片段覆蓋長度最短，為76．6 cM，覆蓋12號染色體基因組的0．77倍。除7號、10號、11號、12號染色體的代換片段沒有完全覆蓋各自的染色體基因組外，其余都覆蓋了整條染色體基因組。

圖5 染色體片段代換系的代換片段長度的變異

表1 染色體片段代換系各染色體目的代換片段長度

3 討論

3.1 染色體片段代換系構(gòu)建的策略

染色體片段代換系作為發(fā)掘和鑒定有利基因的有力工具得到了廣泛的應(yīng)用[16]。染色體片段代換系（chromosomal segment substitution lines,CSSL），又稱為染色體片段導(dǎo)入系（chromosomal segment introgression lines,CSIL）。基本的構(gòu)建過程是：供體與受體雜交獲得F1；受體作為輪回親本，回交獲得BCnF1；自交，獲得目的位點基因型純合的個體，借助分子標(biāo)記選擇，篩選來自供體的一個或多個代換片段的單株；所選單株的代換片段互相重疊，覆蓋全基因組，組成染色體片段代換系?？梢圆扇煞N主要的策略：（1）BC1F1進行分子標(biāo)記選擇，一開始就選定目的代換片段，組成完整的一套片段代換系，覆蓋整個基因組。不斷回交，在以后的世代中，一直選擇目的代換片段，同時進行背景選擇，直到獲得只有目的代換片段或帶少數(shù)幾個非目的代換片段的單株，所有這些單株的目的代換片段互相重疊，覆蓋全基因組，這樣就獲得了一套完整的染色體片段代換系。這樣的策略，獲得的代換片段長，但回交工作量大，耗時長。這是日本前期構(gòu)建染色體片段代換系的策略。（2）在BC1F1群體中隨機選擇48株回交，得到48個株系，每個株系中隨機選擇1株回交，得到48個BC3F1株系，每個株系隨機選1株自交，得到48個BC3F2株系，每個株系選200～300株，進行分子標(biāo)記基因型鑒定，篩選目的代換片段，下同方法1。這種方法，回交工作量小，耗時短，但分子標(biāo)記鑒定工作量大。在染色體片段代換系構(gòu)建過程中，可以把這兩種方法結(jié)合起來，做到取長補短。

3.2 染色體片段代換系的應(yīng)用

以染色體片段代換系為材料可以提高對復(fù)雜農(nóng)藝性狀基因定位的精確性，尤其適用于遺傳效應(yīng)較小的數(shù)量性狀基因定位與克隆。在初步定位的基礎(chǔ)上，含有目標(biāo)QTL的代換系與受體親本雜交，建立次級分離群體，使QTL定位分析錨定在很窄的染色體片段上，進一步消除遺傳背景的干擾，從遺傳上和統(tǒng)計上保證了QTL的精確定位。在明確控制重要性狀基因的基礎(chǔ)上，大力發(fā)掘和評價其等位性變異，可以開展設(shè)計育種[17]。這一過程中，利用已經(jīng)鑒定出的各種重要育種性狀QTL的信息，包括QTL在染色體上的位置、遺傳效應(yīng)、QTL之間的互作、QTL與背景親本和環(huán)境之間的互作等，模擬預(yù)測各種可能基因型的表現(xiàn)型，從中選擇符合特定育種目標(biāo)的基因型，大幅度提高育種效率[18]。

本研究得到中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所儲成才研究員的大力支持，謹(jǐn)致謝意!