黃業(yè)偉，高 晨，顏 平，張 蒙，張冬英，吳曉云

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意義】胰島素(INS)發(fā)展至今已有近百年的歷史，胰島素治療是目前公認(rèn)的最有效的糖尿病核心療法，它是降血糖的唯一激素[1-2]。糖尿病患者經(jīng)過有效安全的胰島素治療后，血糖可以長(zhǎng)期達(dá)標(biāo)，糖尿病并發(fā)癥發(fā)病幾率顯著降低，這對(duì)提高患者生活質(zhì)量與延長(zhǎng)壽命具有至關(guān)重要的作用[3-5]。但是，現(xiàn)在許多糖尿病患者不良的飲食和生活習(xí)慣導(dǎo)致血糖水平控制不佳，影響胰島素藥物治療效果，甚至引起糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生。而對(duì)于有喝茶習(xí)慣的糖尿病病人，喝完茶后是否會(huì)影響血液中胰島素水平，從而減弱胰島素治療效果，目前還沒有確切的結(jié)論。【前人研究進(jìn)展】黃業(yè)偉等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚和兒茶素類物質(zhì)具有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，易與疏水性物質(zhì)結(jié)合，例如咖啡因、脂類等[6]。王素敏等研究發(fā)現(xiàn)氧化型茶多酚能與體內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合，抑制腸道對(duì)其吸收，增加糞便脂類的排出[7]。Shan等在以SD大鼠為對(duì)象研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶中的主要茶多酚物質(zhì)——氧化型茶多酚可以與阿替洛爾結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制機(jī)體對(duì)阿替洛爾的吸收，并促進(jìn)其從糞便中排出，進(jìn)而影響藥物的治療效果[8]。盧浩等曾用普洱茶中的氧化型茶多酚對(duì)食用黃曲霉毒素飲食的SD大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期治療后，氧化型茶多酚能夠與黃曲霉毒素B1結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制黃曲霉毒素B1的吸收，進(jìn)而抑制其對(duì)肝臟的毒性[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】EGCG作為茶葉中兒茶素的主要成分，也具有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，表明EGCG也易與疏水物質(zhì)結(jié)合；胰島素蛋白的表面具有疏水性位點(diǎn)，其與EGCG之間是否會(huì)發(fā)生相互作用，從而阻礙血液中胰島素發(fā)揮藥效，此方面研究報(bào)道甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究EGCG是否會(huì)影響血液中胰島素和胰高血糖素的檢測(cè)，以及飲用茶是否會(huì)影響糖尿病病人血液中的胰島素和胰高血糖素水平，對(duì)于有飲茶習(xí)慣的糖尿病人具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度>98 %，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；鏈脲佐菌素(美國(guó)，Sigma)；一水合檸檬酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；檸檬酸鈉酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；肝素鈉(上海，北京鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司)；抑肽酶(上海，bovinelung，上海邦景實(shí)業(yè)有限公司)；胰島素試劑盒(美國(guó)，Crystal chem)；胰高血糖素試劑盒(美國(guó)，Crystal chem)。

1.2 主要儀器

Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；SK-18TC型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，中國(guó))；超純水機(jī)(普力菲爾理化檢測(cè)型)；血糖儀(三諾，中國(guó))；磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；電子天平(北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(HITACHI，日本)；4 ℃生物藥品柜(海爾，中國(guó))；掌上離心機(jī)(TOMY公司，日本)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾，中國(guó))；移液槍 (吉爾森、Eppendorf)；制冰機(jī)(三洋電機(jī)，中國(guó))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試劑盒檢測(cè)方法 從4 ℃冰箱取出胰島素(型號(hào)90080，美國(guó)Crystal chem)和胰高血糖試劑盒(型號(hào)81504，美國(guó)Crystal chem)，于室溫平衡30 min。胰島素試劑盒使用方法：配制胰島素標(biāo)準(zhǔn)品，向96孔板中加入5 μl的樣品和標(biāo)品后再向每孔加入95 μl的樣品稀釋液，貼膜4 ℃孵育2 h，洗板6次后加入100 μl酶共軛稀釋劑后室溫孵育1 h。最后洗板6次，加入100 μl顯色液TMB 30 min后終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm和630 nm的吸光度值。

胰高血糖素試劑盒使用方法：配制胰高血糖素標(biāo)準(zhǔn)品，向96孔板中加入50 μl的樣品和標(biāo)品后再向每孔加入50 μl的標(biāo)記抗原，貼膜4 ℃孵育44～48 h，洗板3次后加入SA-HRP溶液，貼膜，搖床上室溫孵育1 h，洗板3次加入100 μl顯色液OPD Tablet 20 min后終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)490和630 nm的吸光度值。

1.3.2 EGCG對(duì)胰島素和胰高血糖素含量測(cè)定的影響 在體外實(shí)驗(yàn)中，向裝有正常大鼠血液的離心管中分別加入胰島素與胰高血糖素，隨后分別加入不同濃度的EGCG。EGCG對(duì)胰島素含量的測(cè)定有6個(gè)處理，處理1：EGCG 2 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理2：EGCG 1 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理3：EGCG 0.5 mg/mL +胰島素20 ng/mL、 處理4：EGCG 0.25 mg/mL +胰島素20 ng/mL、 處理5：EGCG 0.125 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理6：胰島素20 ng/mL。分別與胰高血糖素2000 pg/mL在相同時(shí)間內(nèi)混勻通過高速離心相互作用，最后用胰島素試劑盒和胰高血糖素試劑盒進(jìn)行含量的測(cè)定。

1.3.3 STZ糖尿病SD大鼠模型建立 將SD大鼠隨機(jī)分組，動(dòng)物飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼養(yǎng)室，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，開始實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境2周。造模前動(dòng)物禁食12～16 h，次日早上測(cè)空腹體重，空腹血糖。提前制備檸檬酸緩沖液，稱取鏈脲佐菌素STZ，并將其溶于檸檬酸緩沖液中。注射時(shí)用檸檬酸緩沖液以1 % 的濃度溶解STZ，0.22 μm濾膜過濾消毒。按空腹體重55 mg/kg腹腔注射相應(yīng)的鏈脲佐菌素(STZ)，在30 min內(nèi)注射完畢[10]。連續(xù)注射3～5 d，監(jiān)測(cè)血糖情況，空腹血糖濃度高于11.6 mmol/L 視為建模成功。

1.3.4 EGCG對(duì)STZ糖尿病SD大鼠的影響 將建模完成的糖尿病大鼠隨機(jī)分成4組：EGCG+INS聯(lián)用組、INS組、EGCG組及對(duì)照組，稱重。EGCG+INS聯(lián)用組、EGCG組按100 mg/kg體重灌胃EGCG，其他組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，15 min后EGCG+INS聯(lián)用組、INS組皮下注射胰島素1 U/kg體重，其他組皮下注射相應(yīng)體積的生理鹽水。每隔30 min(持續(xù)到120 min)對(duì)大鼠進(jìn)行眼底靜脈叢采血1 mL，注入加入抑肽酶10 μl的采血管中，離心制備血漿。取相應(yīng)的血漿，利用試劑盒對(duì)血液中的胰島素和胰高血糖素水平進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件，利用4-PL分析計(jì)算出胰高血糖素、胰島素的含量。利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

圖1 EGCG對(duì)胰島素含量檢測(cè)的影響Fig.1 Effect of EGCG on the detection of insulin

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)胰島素和胰高血糖素檢測(cè)的影響

2.1.1 EGCG對(duì)胰島素含量檢測(cè)的影響 胰島素作為一個(gè)重要的激素，對(duì)人體血糖具有調(diào)節(jié)作用。通過體外實(shí)驗(yàn)研究EGCG對(duì)胰島素檢測(cè)的影響。如圖1所示，血液中不同濃度EGCG(濃度范圍為0～2 mg/mL)與胰島素混合后，所有EGCG處理組(處理1～5)與單獨(dú)胰島素組(CK)相比，沒有顯著性差異，這說(shuō)明EGCG不會(huì)干擾胰島素水平的檢測(cè)。

2.1.2 EGCG對(duì)胰高血糖素含量檢測(cè)的影響 如圖2所示，血液中不同濃度EGCG(濃度范圍為0～2 mg/mL)與胰島素混合后，結(jié)果顯示，低濃度的EGCG組(處理3～5)與胰高血糖素組(CK)之間胰高血糖素含量沒有顯著差異，而高濃度的EGCG組(處理1～2)中胰高血糖素含量要比胰高血糖素組(CK)顯著升高。這表明高濃度的EGCG會(huì)影響對(duì)胰高血糖素的檢測(cè)，為了保證血液中胰高血糖素檢測(cè)的準(zhǔn)確性，后續(xù)試驗(yàn)中血液EGCG的濃度不得高于1 mg/mL。

與CK相比，*為P<0.05Compared with the control group, * means P<0.05圖2 EGCG對(duì)胰高血糖素含量檢測(cè)的影響Fig.2 Effect of EGCG on the detection of exogenous glucagon

與對(duì)照組比較，* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001Compared with the control group, * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001圖3 糖尿病模型大鼠血糖變化Fig.3 Changes of blood glucose in diabetic rats

2.2 糖尿病大鼠的血糖及體征變化

SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)成胰島素缺乏型的糖尿病動(dòng)物模型。糖尿病動(dòng)物模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)是隨機(jī)血糖大于11.6 mmol/L[11]。圖3顯示STZ建模組在注射后第3天的時(shí)候，血糖開始逐漸上升，到第9天血糖值已達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，這說(shuō)明已經(jīng)建模成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些建模成功的大鼠體重明顯減少，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀。

2.3 EGCG對(duì)STZ糖尿病大鼠的血糖影響

將EGCG 100 mg/kg (相當(dāng)于血液中濃度低于1 mg/mL)的劑量給糖尿病鼠灌胃(模擬糖尿病病人飲用茶)，以15 min/次灌胃持續(xù)120 min，測(cè)定血糖。結(jié)果如圖4所示，胰島素組與對(duì)照組相比，EGCG組與胰島素組相比，聯(lián)用組與對(duì)照組相比，EGCG組與聯(lián)用組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異極顯著。而EGCG組與對(duì)照組相比，血液中的血糖并沒有顯著改變；EGCG+INS聯(lián)用組與INS組相比，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上降血糖效果差別不顯著。以上結(jié)果表明，EGCG灌胃糖尿病大鼠，不影響胰島素注射對(duì)機(jī)體的影響，對(duì)機(jī)體無(wú)降血糖作用。

對(duì)照組與胰島素組比較，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG組與胰島素組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；對(duì)照組與聯(lián)用組比較，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG組與聯(lián)用組比較，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。圖4 EGCG對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響Fig.4 Effect of EGCG on blood glucose in diabetic rats

對(duì)照組與胰島素組比較，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG組與胰島素組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；對(duì)照組與聯(lián)用組比較，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG組與聯(lián)用組比較，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。圖5 EGCG對(duì)血液胰島素含量的影響Fig.5 Effect of EGCG on serum insulin content

2.4 EGCG對(duì)STZ糖尿病大鼠血液激素水平的影響

2.4.1 EGCG對(duì)血液中胰島素含量的影響 胰島素和胰島素受體結(jié)合，激活胰島素下游信號(hào)通路，促進(jìn)糖原合成及全身組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，從而起到降血糖作用[12]。如圖5所示，對(duì)血液中胰島素含量進(jìn)行檢測(cè)，EGCG組與對(duì)照組比較沒有顯著性的差異。由于EGCG+INS聯(lián)用組與INS組中有外源的胰島素注入，所以血液中胰島素含量比較高；而EGCG+INS聯(lián)用組與INS組相比，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒有顯著差異，這表明EGCG干預(yù)不會(huì)引起血液中胰島素水平變化，對(duì)胰島素的降血糖效果無(wú)影響。

2.4.2 EGCG對(duì)血液中胰高血糖素含量的影響 胰高血糖素可以促進(jìn)糖原分解和糖異生，使血糖明顯升高，這是影響血糖的重要因素[13-14]。如圖6所示，EGCG+INS聯(lián)用組、INS組、EGCG組及對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胰高血糖素的含量沒有顯著性差異，這表明EGCG不會(huì)影響糖尿病大鼠血液中胰高血糖素水平。

3 討 論

胰島素及胰高血糖素是調(diào)節(jié)人體血糖平衡的主要激素，在維持其穩(wěn)態(tài)確保血糖在正常水平非常重要。EGCG作為茶葉中的主要成分，山云等研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中多酚類物質(zhì)有強(qiáng)吸附能力，對(duì)藥物的藥效有減弱的作用[8]。而EGCG作為茶多酚中主要成分，對(duì)于有飲茶習(xí)慣的糖尿病人，是否會(huì)影響其治療效果，目前尚無(wú)研究報(bào)道。

圖6 EGCG對(duì)血液胰高血糖素含量的影響Fig.6 Effect of EGCG on serum glucagon content

文章首先檢測(cè)了不同濃度的EGCG對(duì)血液中的胰島素和胰高血糖素含量的影響，以確定合適的EGCG濃度對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行灌胃。其次通過模擬飲茶方式，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行EGCG灌胃，檢測(cè)機(jī)體血糖、胰島素和胰高血糖素水平，探討EGCG對(duì)胰島素治療糖尿病大鼠的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的EGCG對(duì)胰島素含量檢測(cè)沒有影響，但高濃度的EGCG(2和/1 mg/mL)會(huì)使胰高血糖素的檢測(cè)值偏高，其具體原因有待于進(jìn)一步研究。因此，在灌胃糖尿病大鼠時(shí)，宜將EGCG濃度控制在1 mg/mL以下，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

以往研究表明EGCG具有減緩胰島素抵抗的作用，Potenza等在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)胰島素有增敏作用[15]。但是針對(duì)胰島素缺乏的動(dòng)物模型，EGCG有無(wú)作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。糖尿病人往往會(huì)出現(xiàn)胰島素缺乏現(xiàn)象，也會(huì)常常采用胰島素治療。那么胰島素治療的糖尿病人是否能夠正常飲茶而不影響治療效果呢？這個(gè)問題有必要進(jìn)行探討，從而為糖尿病人提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過EGCG灌胃的方式，模擬飲茶習(xí)慣，觀察EGCG對(duì)胰島素注射后的糖尿病大鼠的降血糖作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG灌胃2 h內(nèi)，糖尿病大鼠的血糖水平并沒有降低，EGCG聯(lián)合胰島素組與胰島素組相比血糖差異不顯著，這與以往文獻(xiàn)[16-17]中報(bào)道不符，這可能與藥物干預(yù)時(shí)間過短或EGCG容易被氧化，生物利用度差的特點(diǎn)有關(guān)[18]。研究結(jié)果表明，聯(lián)用組與胰島素組之間，EGCG組與對(duì)照組之間胰島素和胰高血糖素的含量沒有顯著性差異，此結(jié)果說(shuō)明飲用富含EGCG的茶對(duì)糖尿病病人血液中胰島素和胰高血糖素水平無(wú)影響，不會(huì)干擾胰島素藥效。

4 結(jié) 論

低濃度的EGCG處理(低于1 mg/mL)不會(huì)引起胰島素和胰高血糖素檢測(cè)的失真；EGCG對(duì)胰島素治療的糖尿病大鼠血液中血糖、胰島素和胰高血糖素水平檢測(cè)沒有影響。總之，飲用富含EGCG的茶不會(huì)影響使用胰島素治療的糖尿病病人血液中的血糖、胰島素和胰高血糖素水平，對(duì)胰島素的治療效果無(wú)影響。