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(徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

大蒜具有殺菌、抗血栓、降血脂、預(yù)防中風和高血壓、保護肝臟和提高肌體免疫力、抗癌等功能，而加工成黑蒜、琥珀大蒜產(chǎn)品可進一步提高其抗氧化能力。其原理是美拉德反應(yīng)生成類黑精、還原酮、含氮、含硫雜環(huán)化合物和多酚類化合物[1]，多酚類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖水平、抗誘變等特性。本實驗開發(fā)的琥珀大蒜是以新鮮大蒜為原料，經(jīng)高溫高濕發(fā)酵及烤制而成的大蒜深加工產(chǎn)品。琥珀大蒜的發(fā)酵過程是自身發(fā)生的理化反應(yīng)，且在發(fā)酵過程中用蜂蜜上色，使大蒜外觀呈琥珀的色澤。實驗探討了琥珀大蒜的加工工藝，研究了溫度、濕度、時間、氨基酸和還原糖等對琥珀大蒜產(chǎn)品褐變程度及總酚含量的影響；優(yōu)化其工藝參數(shù)，實驗確定的工藝與配方對該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化加工具有重要指導(dǎo)意義[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

WF32色差儀、BE-TH-80H8可程式恒溫恒濕試驗機、HH-B11-500S電熱恒溫培養(yǎng)箱、Q-TBCR2可見分光光度儀、K3042全能王多功能電熱鍋、PM6508數(shù)字溫濕度計、02810253真空抽濾機、FA1004B電子天平、實驗室玻璃器具等。

1.2 原料與試劑

新鮮大蒜、蜂蜜；食品級L-半胱氨酸、食品級賴氨酸、食品級甘氨酸、食品級乳糖、食品級核糖；福林-酚試劑、碳酸鈉、沒食子酸、95%乙醇、甲醇等分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 琥珀大蒜的生產(chǎn)工藝

大蒜→挑選→儲藏→調(diào)配溶液→加熱→保溫→冷卻→浸泡→清洗→瀝水→發(fā)酵→冷卻→上色→烤制→冷卻→計量→裝瓶→封口→冷卻→成品。

1.3.2 工藝操作要點

1.3.2.1 大蒜的預(yù)處理

市購的獨頭蒜可以用來生產(chǎn)琥珀大蒜，云南洱海的獨頭蒜因其獨特的生長環(huán)境而具有更高的含糖量。應(yīng)選擇飽滿充實、體型較大、無破損、未發(fā)芽的大蒜為原料。將大蒜去蒂并去外層皮，沖洗干凈，避光低溫儲藏。

1.3.2.2 配制美拉德反應(yīng)溶液

做不同氨基酸和還原糖添加量的正交表，正交表為3因素4水平，并加40 g水和1 g蜂蜜，用玻璃棒攪拌，配制成16種不同的溶液于燒杯中，放入水浴鍋中煮，水浴鍋預(yù)熱至100 ℃，反應(yīng)時間為1 h，反應(yīng)結(jié)束后保溫冷卻。

1.3.2.3 浸泡大蒜

將16種溶液一一標好序號，將準備好的大蒜浸泡其中，每個燒杯放2～3瓣大蒜，浸泡時間為12 h，用保鮮膜將每個燒杯密封好，防止外界雜質(zhì)進入。浸泡后的大蒜因反應(yīng)溶液的浸入會出現(xiàn)輕微變色，浸泡結(jié)束后清洗、瀝水。

1.3.2.4 放入培養(yǎng)箱發(fā)酵

將浸泡好的大蒜粒拿出，標好對應(yīng)的序號，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱發(fā)酵[3]。對發(fā)酵的溫度、濕度、時間做3因素3水平的正交表，選出最佳的工藝條件，使得大蒜發(fā)酵可以達到最佳的工藝效果。待大蒜進入熟化階段、顏色變?yōu)楹稚纯赡贸隼鋮s。

1.3.2.5 蜂蜜上色

蜂蜜的主要成分是單糖類物質(zhì)，代替白糖用來上色的優(yōu)勢是更容易掌握和更好成色，當溫度達到一定程度時，單糖就能呈紅色。將烤箱預(yù)熱至100 ℃，在所有大蒜外刷上一層蜂蜜，放入烤箱烤制10 min拿出冷卻，此時大蒜外層的蜂蜜已有些呈固態(tài)，再將所有的大蒜外層刷上蜂蜜，放入烤箱于110 ℃烤制10 min拿出冷卻，貼近大蒜的那一層蜂蜜已呈固態(tài)，靠外的一層蜂蜜有些呈固態(tài)，此時再刷一層蜂蜜，放入烤鍋于120 ℃的溫度下烤制10 min，拿出冷卻12 h，直至外層蜂蜜冷卻至固態(tài)，此時的大蒜外觀有琥珀的色澤和甜軟的口感。

1.3.2.6 計量

將每個發(fā)酵后的琥珀大蒜用電子天平稱重，觀察反應(yīng)前后的變化。

1.3.2.7 裝瓶

將冷卻好的琥珀大蒜裝瓶，隔絕外界的灰塵等雜質(zhì)，防止污染和氧化，延長琥珀大蒜的保藏期限。裝瓶結(jié)束后封口、冷卻，則制成成品。

1.3.3 加工方式的選擇方法

對于調(diào)配的美拉德反應(yīng)溶液是否加熱后與大蒜反應(yīng)以及與大蒜反應(yīng)的方式，是浸泡大蒜或?qū)⒋笏馀c溶液放入真空泵抽真空，使溶液滲入大蒜中，分別進行2次對比實驗，測出不同加工方式制成的琥珀大蒜的色差及總酚含量，選出最佳的加工方式。

1.3.4 單因素試驗方法

大蒜發(fā)酵成琥珀色的原理是在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)形成的，美拉德反應(yīng)的底物是氨基酸和還原糖，以溫度、濕度、時間、氨基酸和還原糖為因素進行單因素試驗，研究其對琥珀大蒜褐變程度和總酚含量的影響。

1.3.5 工藝條件及配方的正交試驗

1.3.5.1 溫度、濕度、時間的正交試驗

溫度、濕度、時間是影響大蒜發(fā)酵的工藝參數(shù)，設(shè)計正交試驗表優(yōu)化工藝參數(shù)，選出最佳的工藝條件(見表2)。

1.3.5.2 氨基酸與還原糖的正交試驗

美拉德反應(yīng)受較多因素的影響，反應(yīng)體系的底物是其中一個極其重要的因素。美拉德反應(yīng)的反應(yīng)底物包括糖類和氨基化合物[4]。實驗選擇的氨基酸是賴氨酸、甘氨酸和半胱氨酸，還原糖選擇的是乳糖和核糖，以這些為主要原料，根據(jù)以上正交試驗確定好最佳溫度、濕度和時間的條件下進行美拉德反應(yīng)，在此確定一個不同氨基酸和還原糖組合的3因素4水平正交表。稱取不同的量后，分別加40 g水和1 g蜂蜜。對依此發(fā)酵的琥珀大蒜分別測其色差及總酚含量，選擇最佳工藝配方，正交因素水平表見表1。

表1 氨基酸與還原糖的正交試驗因素水平表

1.3.6 琥珀大蒜品質(zhì)的測定方法

1.3.6.1 褐變程度的測定

琥珀大蒜的褐變程度主要是利用大蒜的顏色變化來反映，需要用到色差儀，色差儀根據(jù)人的雙眼對光的感知程度進行測量，主要測量顯示出標準樣品和試樣之間的色差ΔE，也就是顯示新鮮大蒜與琥珀大蒜顏色的變化程度。ΔE被定義為琥珀大蒜的總色差，ΔE數(shù)值越大，說明大蒜的色差越大，即褐變程度越大。使用色差儀要遵循正確的測量方法。

1.3.6.2 總酚含量的測定

本實驗采用福林-酚比色法測定總酚含量。繪制標準曲線及琥珀大蒜總酚含量的測定按鮑建峰、崔春蘭等報道的方法進行[5，6]。根據(jù)下式計算總酚含量：

X=C×50/m。

式中：X為每克琥珀大蒜樣品中含有的總酚的毫克數(shù)，mg/g；C為琥珀大蒜提取液中含有的總酚的濃度，mg/mL；m為每個琥珀大蒜樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的結(jié)果與分析

測得的沒食子酸的標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，沒食子酸標準曲線的回歸方程為y=0.0018x+0.1172,R2=0.9927，吸光度與總酚的濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 工藝條件對琥珀大蒜品質(zhì)影響的結(jié)果與分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對琥珀大蒜品質(zhì)的影響

按1.3.4的實驗方法進行此實驗。發(fā)酵溫度分別選用5個水平：60，70，80，90，100 ℃，其他工藝條件及試劑的添加保持不變，結(jié)果分析見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of honeyed garlic

由圖2可知，溫度對琥珀大蒜的品質(zhì)有很大影響。溫度越高，琥珀大蒜的褐變程度越高，而總酚含量相反，溫度太高或太低都不利于琥珀大蒜的發(fā)酵，溫度低于75 ℃時，會減緩大蒜發(fā)酵的速度，而溫度高于90 ℃，也會抑制大蒜發(fā)酵，所以發(fā)酵溫度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)。

2.2.2 發(fā)酵濕度對琥珀大蒜品質(zhì)的影響

按1.3.4的實驗方法進行此實驗。發(fā)酵濕度分別選用5個水平：55%，65%，75%，85%，95%，其他工藝條件及試劑的添加保持不變，結(jié)果分析見圖3。

圖3 發(fā)酵濕度對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation humidity on the quality of honeyed garlic

由圖3可知，濕度對琥珀大蒜品質(zhì)的影響很大。濕度越大，琥珀大蒜褐變程度越高，在濕度為小于85%時，琥珀大蒜褐變越快；在濕度大于85%時，琥珀大蒜褐變的程度趨于平穩(wěn)。而濕度小于85%時，濕度越大，琥珀大蒜產(chǎn)生的總酚含量越多；濕度大于85%時，濕度越大，總酚含量越少，所以濕度要選在合理的范圍內(nèi)。

2.2.3 發(fā)酵時間對琥珀大蒜品質(zhì)的影響

按1.3.4的實驗方法進行此實驗。發(fā)酵時間分別選用5個水平：5，6，7，8，9 h，其他工藝條件及試劑的添加保持不變，結(jié)果分析見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of honeyed garlic

由圖4可知，時間對琥珀大蒜的品質(zhì)有很大的影響。隨著時間的增加，琥珀大蒜的褐變程度越大。而在時間小于8 h時，琥珀大蒜的總酚含量隨著時間的增加而增加；而大于8 h時，總酚含量減少，所以發(fā)酵時間不可以過長，要選擇合適的時間。

2.3 工藝配方對琥珀大蒜品質(zhì)影響的結(jié)果與分析

2.3.1 不同氨基酸對琥珀大蒜品質(zhì)的影響

按1.3.4的實驗方法進行此實驗。本實驗選用3個水平：賴氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，研究這3個水平對琥珀大蒜品質(zhì)的影響，這3個水平分別取2 g，與1.5 g乳糖、1.5 g 核糖配成溶液反應(yīng)，其他的工藝條件及試劑不變，結(jié)果分析見圖5。

圖5 不同氨基酸對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different amino acids on the quality of honeyed garlic

由圖5可知，氨基酸的種類對琥珀大蒜的影響很大，氨基酸種類會直接影響美拉德反應(yīng)的進行。賴氨酸對琥珀大蒜褐變程度及總酚含量影響最大，其次是甘氨酸，半胱氨酸的影響最小。賴氨酸屬于堿性氨基酸，堿性氨基酸對美拉德反應(yīng)的反應(yīng)速度有很大的促進作用[7]，所以為了促進琥珀大蒜發(fā)生美拉德反應(yīng)，應(yīng)選用賴氨酸或者氨基酸中賴氨酸的比重應(yīng)該最大。

2.3.2 不同還原糖對琥珀大蒜品質(zhì)的影響

按1.3.4的實驗方法進行此實驗。本實驗選用2個水平：乳糖、核糖，研究這2個水平對琥珀大蒜品質(zhì)的影響，這2個水平分別取1 g，與2 g賴氨酸、1 g甘氨酸配成溶液反應(yīng)，其他的工藝條件及試劑不變，結(jié)果分析見圖6。

圖6 不同還原糖對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different reducing sugars on the quality of honeyed garlic

由圖6可知，還原糖對琥珀大蒜品質(zhì)的影響較大，其中核糖對琥珀大蒜褐變程度及總酚含量的影響比乳糖大，因為單糖分子的美拉德反應(yīng)比雙糖更易進行[8]。所以在選擇還原糖時，要選擇單糖，最好是五碳糖[9]。

2.4 加工方式對琥珀大蒜品質(zhì)影響的結(jié)果與分析

按1.3.5的實驗方法進行此實驗。選擇2 g賴氨酸、1 g甘氨酸、1.5 g乳糖、1.5 g核糖、1 g蜂蜜、40 g水制成溶液，對溶液加熱的選擇和滲入大蒜的方式分別選用4個水平：溶液加熱后浸泡大蒜、溶液不加熱浸泡大蒜、溶液加熱后與大蒜同抽真空、溶液不加熱與大蒜同抽真空。其中加熱是在水浴鍋中100 ℃下加熱1 h，抽真空使用的是循環(huán)水真空抽濾裝置，將溶液和大蒜放入抽濾瓶，打開真空泵，使得大蒜內(nèi)外形成滲透壓，從而溶液可滲入大蒜中。根據(jù)這4個水平進行實驗，然后在溫度85 ℃、濕度85%的條件下發(fā)酵6 h，其他工藝條件和配方保持不變。測定成品的色差及總酚含量，研究加工方式對琥珀大蒜品質(zhì)的影響，測定結(jié)果見圖7。

由圖7可知，不同的加工方式對琥珀大蒜品質(zhì)有較大的影響。配制好的溶液加熱后浸泡大蒜對最后制成的琥珀大蒜的色差影響較大，生成的總酚含量也最高，說明加熱后的溶液浸泡大蒜更能促進大蒜的發(fā)酵。對于大蒜發(fā)酵前后，總酚含量是有顯著增加的，因為隨著溫度的升高推進發(fā)酵的進行，蒜樣中的多酚氧化酶被激活，使得多酚物質(zhì)在其作用下被分解出很多酚羥基，因此總酚含量提高[10]。

圖7 加工方式對琥珀大蒜品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of processing methods on the quality of honeyed garlic

2.5 琥珀大蒜加工工藝優(yōu)化的結(jié)果與分析

2.5.1 工藝條件的優(yōu)化

琥珀大蒜發(fā)酵的主要工藝條件是恒溫恒濕培養(yǎng)箱的設(shè)定溫度、濕度及發(fā)酵時間，利用這3個因素做正交試驗，將大蒜預(yù)處理后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，依據(jù)正交表依次進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后拿出，刷上蜂蜜進行烤制，對成品進行色差及總酚含量的測定，選出最佳的工藝條件。

溫度的3個水平為75，85，95 ℃,濕度的3個水平為75%，85%，95%，時間的3個水平為5，6，7 h，其他原輔料添加量和工藝條件保持不變，設(shè)計3因素3水平L9(33)正交表，得出的分析結(jié)果見表2。

表2 溫度、濕度、時間的正交試驗結(jié)果表Table 2 Orthogonal test results table of temperature，humidity and time

根據(jù)表2正交試驗結(jié)果的極差R值可知，影響琥珀大蒜品質(zhì)的工藝條件因素關(guān)系為：B>A>C，即對琥珀大蒜品質(zhì)影響最大的是濕度，其次是溫度，時間的影響比較小。最優(yōu)方案為A2B2C2，表明最佳的工藝條件為：溫度85 ℃，濕度85%，時間6 h,在此條件下發(fā)酵的效果最好。

2.5.2 工藝配方的優(yōu)化

為了改善琥珀大蒜發(fā)酵的效果，以氨基酸和還原糖作配方，使其滲入到大蒜中幫助更好地發(fā)酵。以氨基酸、乳糖、核糖為3個因素，分別設(shè)計4個水平的添加和組合，采用3因素4水平L16(34)正交試驗表，依據(jù)正交表稱量，加入40 g水、1 g蜂蜜，制成16種不同的溶液，在高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)，將大蒜浸泡其中，使得美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物浸入大蒜內(nèi)，浸泡結(jié)束后發(fā)酵，再刷蜂蜜烤制，其他原輔料添加量和工藝條件保持不變，完成此正交試驗。對成品進行色差及總酚含量的測定，并選出最佳的配方。按3.5.2的方法和正交水平表，得出的正交表分析結(jié)果見表3。

表3 氨基酸與還原糖正交試驗結(jié)果表Table 3 Orthogonal test results table of amino acid and reducing sugar

根據(jù)表3正交試驗結(jié)果的極差R值可知，影響琥珀大蒜品質(zhì)的因素關(guān)系為：A>C>B，即氨基酸的添加量對琥珀大蒜品質(zhì)的影響最大，其次為核糖添加量，乳糖添加量的影響最小。琥珀大蒜最佳工藝配方為A1B3C3，即前期美拉德溶液的配制為：添加2 g賴氨酸、1 g甘氨酸、1.5 g乳糖、1.5 g核糖時琥珀大蒜的發(fā)酵效果最好。

2.6 最優(yōu)配方試驗驗證

對最佳成品進行色差及總酚含量的測定，得到最優(yōu)配方下的色差ΔE為58.32,總酚含量為5.68 mg/g。該結(jié)果比每組配方試驗所得結(jié)果都好，且進行3次平行試驗的結(jié)果穩(wěn)定且良好，因此，認為正交試驗設(shè)計所得的配方為最佳配方。

3 結(jié)論

確定制作琥珀大蒜的工藝流程為：大蒜→挑選→儲藏→調(diào)配溶液→加熱→保溫→冷卻→浸泡→清洗→瀝水→發(fā)酵→冷卻→上色→烤制→冷卻→計量→裝瓶→封口→冷卻→成品。

經(jīng)過溫度、濕度、時間、氨基酸與還原糖的單因素試驗，可得出各因素對琥珀大蒜褐變程度及總酚含量的影響：溫度、濕度、時間越大，褐變程度越大；而溫度、濕度、時間需要在一定范圍內(nèi)總酚含量才會高，過高或過低都會抑制琥珀大蒜的發(fā)酵；氨基酸對琥珀大蒜品質(zhì)的影響較大，其中賴氨酸的影響最大，半胱氨酸的影響較小，還原糖的影響較大，核糖比乳糖的影響大。

確定浸泡琥珀大蒜的反應(yīng)溶液的最佳配方為：賴氨酸2 g，甘氨酸1 g，乳糖1.5 g，核糖1.5 g，水40 g，蜂蜜1 g。

通過多次試驗得到琥珀大蒜的最佳工藝條件為：用氨基酸與還原糖配制的美拉德反應(yīng)溶液浸泡大蒜，拿出放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為85 ℃，濕度為85%，時間為6 h，拿出冷卻，刷一層蜂蜜，在烤箱中烤制，溫度為100 ℃，時間為20 min，拿出冷卻。

在最佳配方和最佳工藝條件下，測出琥珀大蒜的色差ΔE為58.32,總酚含量為5.68 mg/g。