方獻(xiàn)平，查倩，奚曉軍，和雅妮，蔣愛麗*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201403）

葡萄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的一種極具威脅性的真菌性病害。病菌分生孢子梗灰黑色，呈樹狀分枝，在相對(duì)濕度75%～100%時(shí)快速生長[1]?；移咸焰呔?～31 ℃下均能對(duì)新梢、葉片、果梗、花序和果實(shí)產(chǎn)生危害。葡萄染病后，新梢和葉片會(huì)出現(xiàn)褐色病斑或灰色霉層，花序萎縮，幼果脫落，成果有凹陷病斑[2]。

近年來，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，葡萄灰霉病防控越來越引起生產(chǎn)者的重視。一方面可通過田間管理降低其危害，另一方面選用抗性品種降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而灰霉病抗性品種材料篩選周期較長、成本高；植物病害的離體抗性鑒定技術(shù)由于不受場(chǎng)地限制，具有省工、省時(shí)、方便快速和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在黃瓜[3]、辣椒[4]和蘋果[5]等作物上廣泛應(yīng)用。在灰霉病抗性鑒定研究方面，任志華等也做了積極有益的探索，在預(yù)先設(shè)定好的22 ℃和90%的相對(duì)濕度下直接進(jìn)行病菌接種，取得了比較好的鑒定結(jié)果[6]。本研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，通過設(shè)置不同的接種溫度、濕度和時(shí)長，探索灰葡萄孢菌侵染葡萄葉片的最佳發(fā)生條件，建立葡萄灰霉病抗性快速鑒定方法，并在現(xiàn)有葡萄品種（系）上進(jìn)行應(yīng)用，以縮短抗性材料的篩選年限，加快育種進(jìn)程。

1 材料及方法

1.1 材料

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由本課題組分離純化，并經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定。對(duì)灰葡萄孢菌接種溫度、濕度和時(shí)長等發(fā)病條件開展研究試驗(yàn)的3個(gè)葡萄品種為：‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’。進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)的另外再加‘醉金香’‘信濃樂’‘陽光玫瑰’‘申愛’‘申豐’‘申華’‘申玉’‘滬培1號(hào)’‘滬培3號(hào)’9個(gè)品種；以及6個(gè)品系‘滬20’‘滬21’‘滬22’‘滬24’‘滬27’‘滬28’。

1.2 方法

選用在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周的菌落，使用打孔器進(jìn)行打孔，將打孔后的菌餅鋪在葡萄葉片背面，并放入人工培養(yǎng)箱（上海皓莊，型號(hào)LI280A）中培養(yǎng)，設(shè)置不同的溫度（15 ℃、20 ℃和22 ℃）、相對(duì)濕度（80%、90%和95%）和時(shí)長（2 d和3 d）組合觀察記錄葉片感染情況，并用智能葉面積測(cè)量系統(tǒng)（托普云農(nóng)，型號(hào)YMJCH）測(cè)算病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后溫度對(duì)葡萄葉片灰霉病抗性的影響

為了摸索灰葡萄孢菌的最佳侵染溫度，預(yù)先統(tǒng)一設(shè)定90%的固定相對(duì)濕度培養(yǎng)條件，并在2 d后觀察病癥表現(xiàn)。在選定的3個(gè)品種中，‘巨峰’呈現(xiàn)出不同溫度培養(yǎng)條件下的顯著感病差異，在20 ℃時(shí)發(fā)病最為明顯，病斑面積達(dá)到了855.30 mm2。‘夏黑’和‘金手指’在20 ℃時(shí)發(fā)病程度比在22 ℃稍高，20 ℃時(shí)病斑面積分別達(dá)到了326.85 mm2和186.27 mm2。3個(gè)品種在15 ℃下，接種2 d后都未見到感病癥狀，病斑面積都為0（圖1）。由此可見，20 ℃可以作為葡萄葉片抗性鑒定過程中灰葡萄孢菌的最佳接種侵染溫度。

2.2 接種后相對(duì)濕度對(duì)葡萄葉片灰霉病抗性的影響

在已經(jīng)明確20 ℃為最佳侵染溫度的基礎(chǔ)上，設(shè)置了80%、90%和95%相對(duì)濕度培養(yǎng)條件，并在2 d后觀察病癥。在選定的3個(gè)品種中，‘巨峰’和‘夏黑’都呈現(xiàn)出在90%和95%相對(duì)濕度培養(yǎng)條件下更易發(fā)病的現(xiàn)象，‘金手指’則在相對(duì)濕度80%時(shí)發(fā)病程度稍重于95%時(shí)發(fā)病程度，病斑面積分別為167.42 mm2和75.43 mm2，推測(cè)可能與品種差異有關(guān)。但‘巨峰’‘夏黑’和‘金手指’3個(gè)葡萄品種葉片都在相對(duì)濕度為90%時(shí)發(fā)病程度達(dá)到最大值，而更高的相對(duì)濕度并未進(jìn)一步加快發(fā)病進(jìn)程（圖2）。由此可見，灰葡萄孢菌接種葡萄葉片過程中的最佳相對(duì)濕度為90%。

圖1 在不同溫度條件下灰葡萄孢菌侵染3個(gè)不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 1 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different temperatures

圖2 在不同濕度條件下灰葡萄孢菌侵染3個(gè)不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 2 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different humidity

2.3 接種時(shí)長對(duì)葡萄葉片灰霉病抗性的影響

在明確最佳接種溫度20 ℃和相對(duì)濕度90%的灰葡萄孢菌侵染后，進(jìn)一步探索了能較明顯區(qū)分發(fā)病差異程度的最佳病菌接種時(shí)長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管侵染時(shí)間從2 d延長到3 d，能進(jìn)一步加劇感染病斑的擴(kuò)大，但同時(shí)不同品種對(duì)病菌的抗性區(qū)分度在變小，差異系數(shù)從0.899降到了0.225（圖3）。由此可見，灰葡萄孢菌接種2 d后的病情指標(biāo)，可以較好地區(qū)分不同葡萄品種對(duì)灰霉病的抗性差異。

2.4 快速抗性鑒定方法在葡萄品種（系）上的應(yīng)用

應(yīng)用建立好的離體葉片快速抗性鑒定方法，在20 ℃和相對(duì)濕度90%條件下接菌2 d，18個(gè)葡萄品種（系）葉片的抗性研究結(jié)果顯示：以‘巨峰’為對(duì)照，葡萄品系‘滬22’對(duì)灰霉病菌的受感染程度最小，感病面積只有3.8 mm2，顯示出高抗性；其余品種（系）抗性從高到低依次為‘申豐’‘滬培1號(hào)’‘金手指’‘夏黑’‘申玉’‘滬20’‘申華’‘信濃樂’‘滬24’‘滬28’‘陽光玫瑰’‘申愛’‘巨峰’‘滬培3號(hào)’和‘醉金香’，而‘滬21’和‘滬27’兩個(gè)品系顯示對(duì)灰霉菌高感癥狀，感染病斑面積分別達(dá)到了1158.12 mm2和1256.64 mm2（圖4）。

3 討論與結(jié)論

低溫、高濕一般是灰霉病流行的主要影響因素，然而并非所有的低溫都符合最佳發(fā)病生長條件。本研究通過系統(tǒng)比較不同溫度、濕度和接種時(shí)間長短，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)20 ℃比15 ℃和22 ℃更加適合灰葡萄孢菌的繁殖；90%的最佳相對(duì)濕度則進(jìn)一步佐證了任志華等研究中試驗(yàn)條件設(shè)置的科學(xué)性[6]，而95%的相對(duì)濕度未進(jìn)一步有效促進(jìn)病菌的侵染進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)上提供了重要指導(dǎo)意義，因此葡萄灰霉病的防治可以通過控制溫濕度來進(jìn)一步抑制病害的發(fā)生。

圖3 在不同接種時(shí)長下灰葡萄孢菌侵染3個(gè)不同葡萄品種葉片的病斑面積比較Figure 3 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different time points

灰葡萄孢菌能侵染葡萄各個(gè)生長階段，而抗病性鑒定是葡萄育種過程中非常關(guān)鍵的一環(huán)；通過抗性材料的篩選可以進(jìn)一步明確育種方向，加快育種進(jìn)程。葡萄抗病性鑒定可以分為田間鑒定和室內(nèi)鑒定，其中田間鑒定操作相對(duì)繁瑣，必須考慮到當(dāng)時(shí)的氣候條件，有些自然情況下存在不發(fā)病的情況。如果在田間用人工接種的方法，則必須充分制造發(fā)病的條件，并且經(jīng)常需要選擇適合發(fā)病的生長地塊。而室內(nèi)鑒定從實(shí)施步驟上來說則相對(duì)簡單，操作可控性更強(qiáng)?？梢越柚斯夂蚴一蛘吲囵B(yǎng)箱，調(diào)控合適的溫度和濕度，創(chuàng)造有利于植株發(fā)病的氣候條件，沒有氣候的限制。對(duì)于想通過快速鑒定手段來達(dá)到抗性材料篩選的目的，室內(nèi)鑒定可以更好的實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。室內(nèi)鑒定法已經(jīng)應(yīng)用于葡萄抗白粉病[7-8]、霜霉病[9]和黑痘病[10-11]等相關(guān)抗性資源鑒定的工作中。在灰霉病種質(zhì)資源抗性鑒定方面，Gabler等[12]通過研究不同葡萄品種果實(shí)對(duì)灰霉菌的抗性特點(diǎn)，確定圓葉葡萄和美洲種具有較好的抗性。段慧[13]也通過研究初步確定了刺葡萄1、4號(hào)高抗灰霉病，而刺葡萄2、3號(hào)高感灰霉病。本研究首先以有抗性差異的3個(gè)葡萄品種葉片材料，對(duì)灰葡萄孢菌接種溫度、濕度和時(shí)間長度等發(fā)病條件進(jìn)行研究，形成了葡萄灰霉病抗性離體葉片快速鑒定方法，并應(yīng)用該法對(duì)‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’‘醉金香’‘陽光玫瑰’和申滬系列等在內(nèi)的18個(gè)葡萄品種和雜交株系的灰霉病抗性進(jìn)行了鑒定和比較。結(jié)果表明，溫度20 ℃、濕度90%是灰葡萄孢菌的最佳侵染條件，在此條件下接種2 d后的病情指標(biāo)可以較好地區(qū)分18個(gè)葡萄品種（系）對(duì)灰霉病的抗性差異，其中葡萄新品系‘滬22’對(duì)灰葡萄孢菌顯示高抗，而‘滬21’和‘滬27’兩個(gè)品系高感灰霉病。

圖4 灰葡萄孢菌對(duì)18個(gè)不同葡萄品種（系）葉片的侵染病斑面積比較Figure 4 Comparison of lesion area of eighteen different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea