, , ,, ,,,*

(1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068; 2.福格森(武漢)生物科技股份有限公司,湖北武漢 430056)

脂質(zhì)體(Liposomes)是由磷脂雙分子層組成的分子組裝體,具有類似生物膜的閉合囊泡結(jié)構,可荷載親水和疏水性成分,親水性成分可被包封于水相囊泡中,疏水性成分可被截留于磷脂雙分子層中[1-5]。脂質(zhì)體具有良好的分散性、生物相容性及安全性,可用于礦物質(zhì)、維生素、抗氧化劑等功能成分的包載。在不利環(huán)境下脂質(zhì)體可起到緩沖作用,從而保護芯材免受外界環(huán)境的影響[6-9]。脂質(zhì)體作為營養(yǎng)組分包載體系已引起食品領域的廣泛關注,Cuomo等[10]利用脂質(zhì)體荷載姜黃素,通過體外消化模型發(fā)現(xiàn)其可顯著提高姜黃素的生物利用率。王坤[11]將脂質(zhì)體包覆巰基化殼聚糖后形成的穩(wěn)定化脂質(zhì)體與β-甘油磷酸鈉進行交聯(lián),制備得到脂質(zhì)體水凝膠,結(jié)果表明水凝膠的生物相容性隨脂質(zhì)體含量的增加而增強。

VB2(Vitamin B2)又稱核黃素,可促進生長發(fā)育和細胞的再生,幫助人體預防和消除口腔內(nèi)、唇、舌及皮膚的炎癥,是人和動物維持機體正常結(jié)構與功能的必需營養(yǎng)物質(zhì)[12-14]。在光照及紫外照射下會產(chǎn)生日光臭味,易受光、熱、金屬離子等因素影響,使其應用受到了限制[15]。目前市場上VB2補充劑多為片劑,不僅無法掩蔽VB2自身的異味,且在人體胃腸道中易受消化液或食物中其他物質(zhì)的破壞,使其在人體內(nèi)的生物利用率降低[16]。本文采用脂質(zhì)體包載VB2,確定了VB2脂質(zhì)體的制備參數(shù),并探究脂質(zhì)體對VB2不良氣味掩蔽的效果及其胃腸穩(wěn)定性,為VB2的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆卵磷脂 美國Sigma-Aldrich公司;膽固醇 國藥集團化學試劑有限公司;VB2武漢盛世天元生物科技有限公司;吐溫80(Tween 80) 國藥集團化學試劑有限公司;磷鎢酸混合物 上海麥克林生化科技有限公司;胃蛋白酶(酶比活力:1∶3000) 上海麥克林生化科技有限公司公司;胰蛋白酶(酶比活力:1∶4000) 上海源葉生物科技有限公司;超純水 MILLIPORE-Q,美國Merck llipore公司;其余常規(guī)試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

Zetasizer Nano-ZS納米粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;MODUL YOD-230真空冷凍干燥機 美國Thermo公司;VCX 800超聲波細胞粉碎儀 美國SONICS公司;F-7000熒光分光光度計 日本日立公司;DELTA 320pH計 瑞士梅特勒-托利多公司;R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琦有限公司;Tecnai G2 20透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;FOX 4000電子鼻 法國阿爾法莫斯儀器有限公司;Direct Q3超純水機 美國默克密理博(Merck Millipore)公司;HJ-8A磁力攪拌器 武漢科爾儀器有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 VB2脂質(zhì)體制備 VB2脂質(zhì)體的制備參考Lasic[17]的制備方法,并在其基礎上進行改進。按一定比例精確稱取卵磷脂、膽固醇,溶于30 mL無水乙醚中,按3∶1 (v/v)加入一定濃度的VB2水溶液,混勻后置于冰水浴中利用超聲波細胞粉碎儀超聲(800 W,40%,超聲3 s,關1 s)5 min得到均一的乳液。將乳液于35 ℃、0.1 MPa的條件下減壓旋蒸40 min除去有機溶劑,待瓶中形成凝膠狀物后,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠塌陷。然后加入40 mL pH7.0的磷酸緩沖溶液和一定比例的Tween 80旋蒸30 min,得到VB2脂質(zhì)體混懸液,在溫度為-47 ℃,真空度為15 Pa下冷凍干燥36 h后得到VB2脂質(zhì)體凍干粉末。

1.2.2 VB2脂質(zhì)體制備條件的確定

1.2.2.1 膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比(r(C/P))的確定 根據(jù)1.2.1中方法制備VB2濃度為0.8%,卵磷脂質(zhì)量比r(T/P)為4∶5,r(C/P)分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的VB2脂質(zhì)體,對其粒徑、ζ-電位以及包封率進行測定(見1.2.3、1.2.4),選擇最適r(C/P)值。

1.2.2.2 Tween 80與(r(T/P))的確定 根據(jù)1.2.1中方法制備VB2濃度為0.8%,r(C/P)為1.2.2.1中檢測到的最佳比例,r(T/P)分別為1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5的VB2脂質(zhì)體,對其粒徑、ζ-電位以及包封率進行測定,選擇最適r(T/P)值。

1.2.2.3 VB2濃度的確定 根據(jù)1.2.1中方法制備r(C/P)及r(T/P)為1.2.2.1與1.2.2.2中的最佳比例,VB2濃度分別為0.4%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的VB2脂質(zhì)體,對其粒徑、ζ-電位以及包封率進行測定,選擇最適VB2濃度。

1.2.3 VB2脂質(zhì)體粒徑及ζ-電位測定 采用納米粒度及電位分析儀測定1.2.2中優(yōu)化的最佳工藝下制得的VB2脂質(zhì)體混懸液粒徑分布及ζ-電位。測定前先將混懸液輕微振蕩搖勻,樣品測定時,溫度25 ℃,折光指數(shù)1.33,分散相折光指數(shù)1.47,吸光指數(shù)0.01,He-Ne激光光源輸出功率4 mW,檢測角度173 °,檢測波長633 nm。

1.2.4 VB2脂質(zhì)體包封率測定

1.2.4.1 標準曲線及VB2脂質(zhì)體包封率計算 在室溫下利用熒光分光光度計,分別測定濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的VB2標準溶液的熒光強度,繪制標準曲線。獲得標曲為y=18.473x+3.663(R2=0.9943,x:VB2濃度,μg/mL,y:熒光強度值)計算VB2脂質(zhì)體中VB2的總質(zhì)量及脂質(zhì)體表面VB2質(zhì)量,并按式(1)計算脂質(zhì)體的包封率。

包封率(%)=(P2-P1)/P2×100

式(1)

其中:P1表示脂質(zhì)體表面VB2的質(zhì)量;P2表示脂質(zhì)體中VB2的總質(zhì)量。

1.2.4.2 脂質(zhì)體表面VB2質(zhì)量測定 室溫下準確稱取20～30 mg VB2脂質(zhì)體干樣品加入20 mL無水乙醇中,100 r/min下磁力攪拌2 min后進行過濾,收集濾液。將濾液于30 ℃、0.085 MPa真空度下進行減壓蒸餾,直至無水乙醇完全揮發(fā),瓶壁內(nèi)側(cè)形成一薄層脂質(zhì)膜,向瓶中加入6～7 mL三氯甲烷洗下瓶中的脂質(zhì)膜,得到混合溶液。然后向混合溶液中加入15 mL超純水以萃取溶液中的VB2,靜置1 h后收集上層溶液,萃取過程重復三次,合并每次萃取后得到的水層(上層)溶液,并用超純水定容至50 mL。取3 mL溶液測定其熒光強度,根據(jù)標準曲線計算脂質(zhì)體表面VB2質(zhì)量。

1.2.4.3 脂質(zhì)體中VB2總質(zhì)量測定 室溫下準確稱取20～30 mg VB2脂質(zhì)體干樣,加入6～7 mL三氯甲烷,待樣品溶解后加入15 mL超純水萃取溶液中的VB2,靜置1 h然后收集上層溶液,萃取過程重復三次,合并每次萃取后得到的上層(水層)溶液,并用超純水定容至50 mL。取3 mL溶液測定其熒光強度,根據(jù)標準曲線計算脂質(zhì)體中VB2質(zhì)量。

1.2.5 VB2脂質(zhì)體微觀形貌觀察 將1.2.2中優(yōu)化的最佳工藝下制得的VB2脂質(zhì)體凍干粉利用蒸餾水制備VB2脂質(zhì)體混懸液,在室溫下用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液將其濃度稀釋至0.02%(w/w),在數(shù)控超聲波清洗裝置中以24 kHz超聲處理10 min,促進樣品分散,然后用移液槍吸取20 μL樣品滴至銅網(wǎng)正面,室溫下風干,隨后用毛細吸管取1%(w/w)磷鎢酸(水浴超聲1 h,32 kHz,0.22 μm水相濾膜過濾)滴至樣品表層,再次室溫風干后,利用透射電子顯微鏡進行觀察。

1.2.6 VB2脂質(zhì)體對VB2氣味掩蔽能力測定 采用電子鼻評價脂質(zhì)體對將1.2.2中優(yōu)化的最佳工藝下制得的VB2脂質(zhì)體不良氣味的掩蔽效果檢測。準確稱取1.00 g VB2脂質(zhì)體凍干粉末于20 mL電子鼻專用頂空瓶中,同時分別以未荷載VB2脂質(zhì)體凍干粉末和VB2原料粉末作為對照組進行實驗,采用聚四氟乙烯隔墊進行密封,置于自動進樣裝置上,加熱箱溫度40 ℃,每個樣品加熱2 min,振蕩速度500 r/min。測定時以合成的干燥空氣為載氣,流速150 mL/min,進樣針溫度50 ℃,注射體積2.5 mL,注射速度2.5 mL/s,獲取時間2 min,延滯時間5 min。每個樣品在上述條件下重復分析4次。

1.2.7 VB2脂質(zhì)體胃腸穩(wěn)定性實驗 模擬胃液的配制:于室溫下準確取濃鹽酸14 mL,氯化鈉4.00 g,胃蛋白酶6.40 g加入1800 mL純水中,充分混合后,調(diào)節(jié)溶液pH至1.3并定容至2 L。模擬腸液的配制:于室溫下準確稱量13.06 g磷酸二氫鉀溶于1 L純水中后,再加入12.70 mL 6 mol/L氫氧化鈉溶液,20.00 g胰蛋白酶和5.00 g膽鹽,充分溶解后調(diào)節(jié)溶液pH至7.5并定容至2 L[18]。移取2 mL蒸餾水制備的VB2脂質(zhì)體混懸液于透析袋中,浸沒于100 mL模擬胃腸液中,在37 ℃下以100 r/min轉(zhuǎn)速攪拌,分別在1、2、3、4、5、10 h測定VB2體外釋放量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSSV 21.0軟件進行顯著性分析,所得數(shù)據(jù)為三次重復(n=3),數(shù)據(jù)采用M±SD表示,兩組數(shù)據(jù)間顯著性差異表示為p<0.05,采用Excel 2.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VB2脂質(zhì)體制備條件的確定

2.1.1 不同r(C/P)對VB2脂質(zhì)體的影響 在磷脂雙分子層中,膽固醇如“緩沖劑”一般起著調(diào)節(jié)膜結(jié)構“流動性”的作用,膽固醇的羥基可與磷脂分子的羥基通過氫鍵結(jié)合形成復合物,使磷脂分子間結(jié)合更為緊密,增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[5]。由圖1可知,VB2脂質(zhì)體粒徑均為單峰分布,當r(C/P)為1∶10、1∶8、1∶4和1∶2時,VB2脂質(zhì)體粒徑分布范圍較窄,呈現(xiàn)出良好的分散性和穩(wěn)定性。

圖1 不同r(C/P)對VB2脂質(zhì)體粒徑分布的影響Fig.1 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different r(C/P)

由表1可知,在r(C/P)為1∶6、1∶8、1∶10條件下制得的VB2脂質(zhì)體包封率較高且無顯著差異(p>0.05),其中r(C/P)為1∶8時,VB2脂質(zhì)體的ζ-電位最大,為-19.4 mV。有研究表明,微粒所攜帶的電荷量多,可提供斥力防止微粒間發(fā)生聚集[17]。當r(C/P)為1∶8時,VB2脂質(zhì)體帶有較強負電,粒子之間存在一定靜電排斥力,脂質(zhì)體微粒可均勻分散于體系中,保持體系的穩(wěn)定。通過綜合考慮VB2脂質(zhì)體粒徑、電位及包封率,選擇r(C/P)為1∶8進行下一步實驗。

表1 不同r(C/P)VB2脂質(zhì)體的ζ-電位及包封率Table 1 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2in different r(C/P)

2.1.2 不同r(T/P)對VB2脂質(zhì)體的影響 Tween 80作為非離子型表面活性劑,加入脂質(zhì)體中可增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。由圖2知,與r(T/P)為2∶5相比,r(T/P)為3∶5和4∶5時,VB2脂質(zhì)體粒徑分布范圍較窄,且呈單峰分布,有利于維持納米脂質(zhì)體懸浮液體系的穩(wěn)定性[19]。存在于脂質(zhì)體雙分子層中Tween 80的聚氧乙烯基可從脂質(zhì)雙層中伸出,致密覆蓋在雙層表面,在脂質(zhì)體外表面形成有一定厚度的親水相,促進脂質(zhì)體曲率的增加,因而得到粒徑較小的脂質(zhì)體,但當Tween 80濃度較小時,部分VB2脂質(zhì)體中Tween 80含量較少,從而導致體系中脂質(zhì)體粒徑不均一[20]。

圖2 不同r(T/P)對VB2脂質(zhì)體粒徑分布的影響Fig.2 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different r(T/P)

如表2所示,不同r(T/P)下VB2脂質(zhì)體所帶負電荷隨Tween 80濃度增加而減小,研究表明,脂質(zhì)體的ζ-電位受脂質(zhì)類型、芯材等影響,電荷變化表明芯材進入磷脂雙分子層中,而電位的下降可能是由于表面活性劑的加入改變了粒子的剪切平面所導致的[21-23]。

表2 不同r(T/P)下VB2脂質(zhì)體的ζ-電位及包封率Table 2 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2in different r(T/P)

表2可知,VB2脂質(zhì)體包封率隨Tween 80含量的增加呈現(xiàn)出增大的趨勢,但當Tween 80添加比例超過3∶5時,脂質(zhì)體的包封率下降。可能是脂質(zhì)體中存在的親脂性基團引起脂質(zhì)體表面“稠化效應”的增強,使膜的有效厚度增加,為VB2提供了良好的存在空間,從而保持較高包封率,但當Tween 80濃度超出一定范圍后,過量的Tween 80造成脂質(zhì)膜雙分子層結(jié)構的破壞,導致包封的VB2泄漏,降低了包封率[18]。因此為保證VB2脂質(zhì)體體系的穩(wěn)定性及脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構的完整性,選擇r(T/P)為3∶5進行下一步實驗。

2.1.3 不同VB2濃度對VB2脂質(zhì)體的影響 由圖3可知,VB2濃度為1.0%、0.8%時制得的VB2脂質(zhì)體粒徑分布為單峰分布,脂質(zhì)體在體系中分散均一。而當VB2濃度為0.4%、1.5%、2%時,脂質(zhì)體的粒徑分布為雙峰分布,可能是由于當VB2濃度為0.4%時,體系中VB2濃度較低,導致體系中形成的部分脂質(zhì)體未荷載VB2,體系中存在已荷載VB2和未荷載VB2兩種脂質(zhì)體;當VB2濃度為1.5%和2%時,體系中VB2含量過高,壁材/芯材比減小,壁材所產(chǎn)生的物理阻隔或屏障作用減小,部分VB2脂質(zhì)體中包載的VB2易泄露到脂質(zhì)體表面,導致脂質(zhì)體顆粒大小不均一[24]。

圖3 不同VB2濃度對VB2脂質(zhì)體粒徑分布影響Fig.3 The particle size distribution of liposomes loaded with VB2 in different concentration of VB2

如表3所示,不同VB2濃度下脂質(zhì)體電位無顯著差異(p>0.05),而包封率隨VB2濃度增加而增加,可能是由于體系中芯材濃度增大,使得脂質(zhì)體囊泡對目標物捕捉更加容易,因而包封率增大[18]。VB2濃度1.0%時,所制備的VB2脂質(zhì)體在體系中分散均勻,具有良好的穩(wěn)定性較高的包封率,其ζ-電位為-12.1 mV,包封率為94.67%。

表3 不同VB2濃度下VB2脂質(zhì)體的ζ-電位及包封率Table 3 ζ-potential and entrapment efficiency of liposomes VB2 in different concentration of VB2

2.2 VB2脂質(zhì)體形貌

如圖4可知,荷載1.0% VB2的脂質(zhì)體大小均一,呈規(guī)則球形結(jié)構且分散均勻,其粒徑較大約為300～500 nm,而荷載2.0% VB2的脂質(zhì)體粒徑較小,呈現(xiàn)不規(guī)則狀并有聚集趨勢,可能是由于2.0% VB2濃度過高,體系中過量的VB2不能被脂質(zhì)體水相囊泡截留,且其壁材/芯材比較1% VB2濃度下的壁材/芯材比小,導致其壁材的物理阻隔作用減小,使脂質(zhì)體內(nèi)部的部分VB2泄漏。

圖4 不同VB2濃度的脂質(zhì)體的TEM圖(7000×)Fig.4 TEM observation of liposomes in different concentrations of VB2(7000×)注:A:0%;B:1.0%;C:2.0%。

2.3 VB2脂質(zhì)體的氣味分析

如圖5,利用電子鼻對獲得的VB2脂質(zhì)體樣品的信號數(shù)據(jù)進行主成分分析,建立前2個主成分的二維判別圖。由圖5A可知,VB2脂質(zhì)體平行檢測的數(shù)據(jù)可構成獨立組群,表明電子鼻分析檢測重現(xiàn)性好。經(jīng)主成分分析,發(fā)現(xiàn)VB2脂質(zhì)體的主成分PC1和PC2的累積方差貢獻率為96.70%,大于85%,說明PC1和PC2包含信息量大,能夠反映VB2脂質(zhì)體的整體信息[25-26]。區(qū)分指數(shù)(discrimination index,DI)為電子鼻軟件提供樣品區(qū)分程度的表征值,該值與區(qū)分效果呈線性相關,最大值為100,本實驗中DI值為91,表明區(qū)分有效[27]。圖5A中VB2脂質(zhì)體和VB2原料分布區(qū)域較遠,說明VB2脂質(zhì)體與VB2原料在氣味上差別明顯,即VB2脂質(zhì)體可成功掩蔽VB2的不良氣味。

圖5B清晰顯示出VB2脂質(zhì)體對18個傳感器的反應信號強度具有不同的響應。其中VB2脂質(zhì)體與VB2原料存在明顯差異,7種傳感器(T40/2、P30/2、P40/2、P30/1、PA/2、T70/2、T30/1)響應值的差異明顯,表明脂質(zhì)體成功掩蓋了原料VB2不良氣味[28]。通過建立樣品指紋圖,可對VB2的不良氣味掩蔽提供理論依據(jù),為設計含VB2的食品配方提供了新思路。

圖5 VB2脂質(zhì)體電子鼻氣味分析Fig.5 Anylyse of liposomes loaded with VB2 by E-nose注:A:VB2脂質(zhì)體主成分分析; B:VB2脂質(zhì)體指紋圖每組樣品做4個平行。

2.4 VB2脂質(zhì)體模擬胃腸液體系下的穩(wěn)定性

如圖6,在模擬胃液中,前2 h內(nèi)VB2脂質(zhì)體的釋放率小于7.0%,4 h VB2釋放率增加至33.1%。可能由于在胃液低pH環(huán)境中,高濃度H+穿過脂質(zhì)雙分子層膜,導致雙分子層膜的滲透性增加,脂質(zhì)體失穩(wěn),被截留在脂質(zhì)體水相的VB2更容易透過雙分子膜[29]。在人工模擬腸液中,前2 h內(nèi)VB2脂質(zhì)體的釋放率約為10.3%,4 h VB2的釋放率增加至49.2%?？赡苁怯捎谀M腸液環(huán)境中的膽鹽會破壞脂質(zhì)體的雙分子層膜,促使VB2釋放[18]。

圖6 VB2脂質(zhì)體在模擬胃腸液體系下的釋放率Fig.6 Releaserate of liposomes loaded with VB2 under simulated gastrointestinal fluid system

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了VB2脂質(zhì)體制備工藝,并對其在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性及對VB2不良氣味的掩蔽進行評價。結(jié)果表明,當r(C/P)=1∶8,r(T/P)=3∶5,VB2濃度為1.0%時制備的VB2脂質(zhì)體ζ-電位為-12.1 mV,包封率為94.67%,微粒形態(tài)規(guī)整,分散均勻。經(jīng)過脂質(zhì)體包封能夠?qū)崿F(xiàn)對VB2不良氣味的掩蔽,且VB2在體外模擬胃腸液中呈緩慢釋放。本研究基于食品結(jié)構化設計理論,構建了不穩(wěn)定營養(yǎng)素VB2的遞送體系,改善了VB2的不良感官特性,為設計含VB2的食品配方提供一定的理論依據(jù)。