于國(guó)萍，岳崇慧，陳 媛，劉 鵬，劉艷秋，董良偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳狀液是一種非均多相分散體系，常見(jiàn)的乳狀液由油水兩相組成。乳狀液通常有2 種類型，即水包油型乳狀液和油包水型乳狀液，其中水包油型乳狀液在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，如加工蛋黃醬、調(diào)味料、飲料、冰激凌等[1]。這些產(chǎn)品的加工可能會(huì)需要混合、剪切、加熱、冷藏、冷凍、脫水處理。其中冷凍處理是食品抑制微生物、維持化學(xué)穩(wěn)定性和延長(zhǎng)貨架期的重要手段之一[2]。水包油乳狀液在冷藏、冷凍食品和藥品中有許多應(yīng)用，而在其使用前往往需要經(jīng)歷冷卻和融化的過(guò)程[3-4]。因此，如何增強(qiáng)乳狀液的凍融穩(wěn)定性成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

在植物源蛋白質(zhì)中，大豆蛋白由于其廣泛的功能特性和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在食品體系中得到廣泛的應(yīng)用[5-7]。然而大多數(shù)大豆蛋白乳狀液在冷凍-解凍的過(guò)程中會(huì)形成冰晶，尖銳的冰晶對(duì)乳狀液界面膜形成機(jī)械破壞，改變?cè)蟹€(wěn)定體系的蛋白-蛋白交互作用，解凍后乳狀液將發(fā)生聚結(jié)、出油和分層等失穩(wěn)現(xiàn)象[8-9]。大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）的功能性質(zhì)可以通過(guò)物理、化學(xué)、酶法進(jìn)行修飾。酶法改性是在溫和條件下利用酶制劑催化蛋白水解或聚合，改變SPI的氨基酸殘基和多肽鏈、破壞蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)、改變蛋白質(zhì)分子的理化性質(zhì)，從而獲得具有較好功能特性和營(yíng)養(yǎng)性的SPI[10]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究主要集中在利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）提高蛋白質(zhì)乳化性[11-13]，對(duì)于利用TGase提高SPI凍融穩(wěn)定性且在TGase改性SPI形成的乳化體系中對(duì)于乳狀液凍融過(guò)程中結(jié)晶晶體形成及融化的熱特性與凍融穩(wěn)定性的關(guān)系研究報(bào)道較少。且已有研究表明添加乳化劑可有效改善冰激凌基料在貯運(yùn)過(guò)程中的穩(wěn)定性，而冰激凌在日常銷售及家庭貯藏期間溫度多為-18 ℃，研究利用優(yōu)質(zhì)蛋白資源SPI制備乳狀液在該溫度條件下進(jìn)行凍融循環(huán)，以期具有實(shí)際意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究?jī)鋈谘h(huán)次數(shù)、TGase交聯(lián)時(shí)間、添加量對(duì)乳化體系的分層系數(shù)、出油率的影響，確定TGase交聯(lián)時(shí)間及添加量，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳確定酶促反應(yīng)對(duì)于蛋白組成的影響，比較分析2 種乳狀液體系顯微結(jié)構(gòu)、熱特性，探究改性蛋白組成及熱力學(xué)行為對(duì)體系凍融穩(wěn)定的影響，從而為大豆蛋白在冷凍食品的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油 黑龍江省哈爾濱市九三集團(tuán)；SPI 北京索萊寶科技有限公司；TGase 泰興市東圣食品科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、蘇丹III試劑 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722-2000型分光光度計(jì) 山東高密彩虹分析儀器有限公司；Pyris6型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 美國(guó)PE公司；T18 Basic高速分散機(jī)/勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；ChampGel 6000全自動(dòng)凝膠成像分析儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TGase交聯(lián)樣品的制備

將SPI用去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%溶液，調(diào)整溫度為50 ℃，調(diào)整pH值至7.0，分別加入一定量的TGase，梯度為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%（酶/底物）開(kāi)始交聯(lián)，反應(yīng)1～5 h后80 ℃加熱5 min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH值至7.0，離心，凍干。同時(shí)以未加TGase的SPI作為零交聯(lián)時(shí)間、零添加量的對(duì)照。

1.3.2 乳狀液的制備

參考Kimura等[14]方法進(jìn)行制備。取15 mL的1% SPI或交聯(lián)樣品加入5 mL大豆油利用高速勻漿機(jī)于12 000 r/min均質(zhì)2 min，制得水包油型乳狀液。

1.3.3 凍融循環(huán)

將制備好的乳狀液置于-18 ℃的冰箱中冷凍22 h后，取出置于40 ℃水浴鍋中解凍2 h，此過(guò)程稱為1個(gè)凍融周期。乳狀液分別進(jìn)行1、2、3 個(gè)凍融周期處理，并在每次循環(huán)后進(jìn)行穩(wěn)定性分析。

1.3.4 分層系數(shù)測(cè)定

取10 mL新鮮乳狀液至離心管中，凍融循環(huán)后，乳狀液開(kāi)始分層，上層為不透明的乳化層，下層為透明的乳清層。分層系數(shù)按公式（1）計(jì)算：

式中：Hs為乳清層高度/cm；Ht為乳狀液總高度/cm。

1.3.5 出油率測(cè)定

參考Palanuwech等[15]的 測(cè)定方法并 略加改動(dòng)。蘇丹III油 溶液的制備：精確稱取 蘇丹III色素0.015 g，加入1 000 g大豆油中在室溫（25 ℃）條件下慢速 攪拌12 h左右，使蘇丹III完全溶解，于波長(zhǎng)508 nm處測(cè)定蘇丹III油溶液的吸光度（A1）。準(zhǔn)確稱取 待測(cè)樣品 乳狀液16 g，制備好的蘇丹III油溶液4 g，混合 均勻，1 000×g離心20 min，用移液槍吸取 乳狀液上層，于15 000×g離心20 min，取上層清液 于波長(zhǎng)508 nm處測(cè)定吸光度（A2）。原油為空白調(diào)零。出油率按公式（2）計(jì)算：

式中：φd為乳狀液中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；M0為加入的蘇丹III油液的質(zhì)量/g；Me為乳狀液的質(zhì)量/g；a=A1/A2。

1.3.6 乳狀液的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察

吸取20 μL乳狀液滴于帶有凹槽的載玻片中心，蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，將載玻片置于載物臺(tái)上觀察，先在4 倍物鏡下找到清晰的視野，然后再10 倍物鏡下放大倍率（10×10）進(jìn)行乳狀液液滴顯微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.7 DSC法測(cè)定

參考Noshad等[16]的 測(cè)定方法并略加改動(dòng)。乳狀液的熱行為利用DSC進(jìn)行表征。吸取10 μL依照1.3.2節(jié)方法制備的SPI新鮮乳狀液、TGase改性SPI新鮮乳狀液置于鋁制坩堝中，然后密封，移至DSC樣品池中，以1 個(gè)空鋁制坩堝作為參比。樣品在DSC中以5 ℃/min從20 ℃到-20 ℃進(jìn)行降溫，然后以相同的速率從-20 ℃到20 ℃進(jìn)行升溫。此溫度循環(huán)重復(fù)3 次。

大豆油的熱行為測(cè)定參考Magnusson等[17]的測(cè)定方法并略加改動(dòng)。大豆油（10 μL）置于鋁制坩堝中，然后密封，移至DSC樣品池中，以1 個(gè)空鋁制坩堝作為參比。樣品在DSC中以5 ℃/min從30 ℃至-30 ℃進(jìn)行降溫。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)染色[18]測(cè)定蛋白質(zhì)的亞基組成及變化。用去離子水將SPI及TGase改性SPI配制成3 mg/mL的樣品溶液，取蛋白樣品溶液與上樣緩沖液1∶1混合，電泳前沸水浴中煮沸5 min。進(jìn)樣量為標(biāo)準(zhǔn)蛋白每孔5 μL，樣品每孔10 μL。實(shí)驗(yàn)中分離膠和濃縮膠分別為12%和5%。樣品在濃縮膠時(shí)電壓為60 V，分離膠電壓為90 V。之后用考馬斯亮藍(lán)染色，最后脫色至條帶清晰，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase對(duì)SPI乳狀液凍融穩(wěn)定性的影響

2.1.1 TGase交聯(lián)時(shí)間對(duì)分層系數(shù)和出油率的影響

如圖1所示，在固定TGase添加量（2.5%）時(shí)，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳狀液的出油率及分層系數(shù)均呈下降趨勢(shì)，均低于SPI（交聯(lián)時(shí)間0 h）。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，乳狀液的出油率及分層系數(shù)最低，乳狀液呈現(xiàn)出較好的抗凍融穩(wěn)定性，而當(dāng)交聯(lián)時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，乳狀液的分層系數(shù)及出油率有所增加，這可能是由于延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白的大量聚集，乳狀液體系發(fā)生絮凝，從而加劇乳狀液分層、油滴的析出[19]。本實(shí)驗(yàn)選取交聯(lián)時(shí)間為3 h。

圖1 TGase交聯(lián)時(shí)間對(duì)乳狀液體系分層系數(shù)（A）和出油率（B）的影響Fig. 1 Effect of TGase crosslinking time on creaming index (A) and oiling off (B)

2.1.2 TGase添加量對(duì)分層系數(shù)和出油率的影響

圖2 TGase添加量對(duì)乳狀液體系分層系數(shù)（A）和出油率（B）的影響Fig. 2 Effect of TGase dosage on creaming index (A) and oiling off (B)

由圖2可知，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為3 h時(shí)，隨著TGase添加量的增加，乳狀液的出油率及分層系數(shù)呈下降趨勢(shì)，均低于SPI。當(dāng)添加量為1.5%時(shí)，乳狀液的出油率及分層系數(shù)最低，乳狀液呈現(xiàn)出較好的抗凍融穩(wěn)定性，而當(dāng)添加量超過(guò)1.5%時(shí)，乳狀液的分層系數(shù)及出油率有所增加，表明大豆蛋白的過(guò)度交聯(lián)會(huì)使其乳化能力下降，油滴聚集。本實(shí)驗(yàn)選取TGase添加量為1.5%。即改性蛋白在制備條件為TGase交聯(lián)時(shí)間3 h、添加量1.5%時(shí)穩(wěn)定性較好，在3 次凍融循環(huán)后，該改性蛋白制備的乳化劑其分層系數(shù)、出油率分別為16.11%、15.59%，而SPI分層系數(shù)及出油率分別為52.15%、48.74%。

隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，乳狀液出油率及分層系數(shù)增大，乳狀液的穩(wěn)定性逐漸下降。其原因主要是，在乳狀液冷凍過(guò)程中，當(dāng)冰晶開(kāi)始形成時(shí)，在未冷凍的液相中分散的乳狀液液滴會(huì)彼此靠近進(jìn)而發(fā)生聚集，此現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于界面膜被破壞進(jìn)而促進(jìn)了乳狀液聚集。而在乳狀液融化過(guò)程中，尖銳的冰晶可能會(huì)物理性的滲透破壞油滴并且打破乳狀液油與水的界面膜，使油滴更加傾向于聚集[9]。另外，當(dāng)乳狀液冷凍時(shí)，SPI可能會(huì)變性進(jìn)而降低其乳化性、保水性、保油性等功能特性[19]。因此，冷凍處理使蛋白的乳化性降低、油-水混合體系中界面膜變得不穩(wěn)定，會(huì)加劇油滴之間的聚集和絮凝，是凍融循環(huán)使乳狀液失穩(wěn)的主要原因。

TGase的交聯(lián)作用一定程度地提高了SPI乳狀液的凍融穩(wěn)定性，一些物理化學(xué)機(jī)制可以用于解釋TGase提高了蛋白在凍融條件下的穩(wěn)定性。TGase的適度添加提高了蛋白乳化性能，形成更加致密穩(wěn)定的界面膜，從而提高蛋白乳狀液的凍融穩(wěn)定性[20]。SPI交聯(lián)后蛋白-蛋白作用的提高、蛋白在界面吸附能力的改善都增強(qiáng)界面蛋白的強(qiáng)度，從而改善SPI的乳化能力[21]。已有研究表明TGase的適量添加可提高蛋白質(zhì)的乳化性。Hu Xiao等[11]利用TGase提高了花生分離蛋白的乳化性能。徐瑩[12]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)TGase對(duì)SPI乳化活性、乳化穩(wěn)定性具有改善作用。黃志良等[13]研究β-酪蛋白經(jīng)TGase不同程度的作用后乳化性質(zhì)的變化。經(jīng)TGase作用，β-酪蛋白所形成的乳化體系的穩(wěn)定性明顯提高。經(jīng)處理，β-酪蛋白形成的乳化體系在30 h內(nèi)未見(jiàn)油水分離，但當(dāng)TGase處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，交聯(lián)程度過(guò)高的情況下，乳蛋白質(zhì)乳化能力會(huì)下降，乳化體系中油滴體積增大。這與本研究中當(dāng)交聯(lián)時(shí)間及酶量添加到一定程度時(shí)，其乳狀液凍融穩(wěn)定性會(huì)下降的結(jié)果相符。其原因可能為蛋白過(guò)度交聯(lián)導(dǎo)致其在乳狀液的均質(zhì)過(guò)程中無(wú)法迅速遷移到油水界面[22]，從而導(dǎo)致乳化能力的下降。另外蛋白的過(guò)度交聯(lián)，會(huì)使蛋白大量聚結(jié)，聚合的蛋白質(zhì)會(huì)吸附在液滴水膜的兩側(cè)，形成“橋連效應(yīng)”，使乳狀液體系發(fā)生絮凝，從而加劇乳狀液分層[19]。其次是黏度的影響，TGase的交聯(lián)增加乳狀液中未冷凍水的量和水相的黏度，使油滴運(yùn)動(dòng)變得困難，降低油滴聚結(jié)現(xiàn)象的發(fā)生[23]。由于TGase部分脫酰胺基作用，其處理會(huì)降低蛋白分子表面疏水性、增加靜電排斥[24]。

2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定結(jié)果

大豆蛋白的主要組分為7S球蛋白和11S球蛋白。7S球蛋白是由α、α′和β亞基構(gòu)成；11S球蛋白是由酸性亞基和堿性亞基通過(guò)二硫鍵組成的六聚體[25-26]。電泳圖譜是分析蛋白質(zhì)亞基組分的重要手段。由圖3可以看出，隨著TGase添加量的提高，TGase改性SPI在116.0 kDa以上出現(xiàn)的新的蛋白條帶顏色逐漸加深，而在45.0～66.2 kDa之間的條帶逐漸消失，部分β-伴球蛋白通過(guò)TGase交聯(lián)或聚合形成了較高分子質(zhì)量的聚合物。這與Tang Chuanhe等[27]研究一致。結(jié)合圖1、2可知，當(dāng)TGase交聯(lián)時(shí)間3 h、TGase添加量1.5%時(shí)制備的TGase改性SPI凍融穩(wěn)定性最佳。條帶3為該條件制備的改性SPI，此時(shí)交聯(lián)程度居中，這也證明交聯(lián)程度過(guò)高，反而使乳狀液凍融穩(wěn)定性下降?？梢灶A(yù)料，TGase改性SPI改變其蛋白質(zhì)組成，使其功能性質(zhì)發(fā)生改變。

圖3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis

2.3 TGase改性對(duì)乳狀液微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4 TGase改性對(duì)乳狀液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of TGase modification on the microstructure of the emulsion

如圖4所示，新鮮SPI、TGase改性SPI乳狀液油滴粒徑較均一、穩(wěn)定。當(dāng)乳狀液經(jīng)凍融處理后，觀察區(qū)域中出現(xiàn)了較大的球狀顆粒，且有明顯的聚結(jié)現(xiàn)象，這說(shuō)明乳狀液的穩(wěn)定性遭到破壞，發(fā)生絮凝、聚結(jié)、油滴上浮。相對(duì)而言，TGase改性SPI與同次循環(huán)的SPI相比聚結(jié)程度相對(duì)較低，上述變化相對(duì)較小。這進(jìn)一步印證了TGase改性大豆蛋白可有效抑制凍融過(guò)程中微觀液滴的聚集現(xiàn)象，從而得到穩(wěn)定性較好的乳狀液。

2.4 凍融過(guò)程中熱特性分析

圖5 大豆油（A）和SPI乳狀液及TGase改性SPI乳狀液（B）DSC曲線Fig. 5 DSC curves of soybean oil (A), SPI emulsion and TGasemodified SPI emulsion (B)

利用DSC可以研究乳狀液體系中油、水結(jié)晶對(duì)于其穩(wěn)定性的影響，結(jié)晶、熔融曲線可用來(lái)區(qū)別被乳化的油和未被乳化的油[15]。利用DSC分析乳狀液樣品之前，本研究使用DSC測(cè)定大豆油在冷凍過(guò)程中的熱行為，如圖5A所示，大豆油開(kāi)始結(jié)晶溫度在-17 ℃左右。說(shuō)明乳狀液在-18 ℃進(jìn)行冷凍時(shí)（僅比大豆油結(jié)晶溫度低1 ℃），油相幾乎保持為液體狀態(tài)。

如圖5B所示，在冷凍過(guò)程中，SPI及其改性產(chǎn)物乳狀液只出現(xiàn)一個(gè)結(jié)晶峰。這是由于連續(xù)相（水相）造成的。基于以上的觀察，可以確定乳狀液微滴在-18 ℃冷凍22 h期間油在其中并沒(méi)有結(jié)晶。所以水包油乳狀液凍融條件下失穩(wěn)主要是由于在冷凍階段冰晶形成失穩(wěn)造成的。

在SPI乳狀液3 次凍融循環(huán)的過(guò)程中，其在20 ℃左右會(huì)觀察到一個(gè)比較明顯的放熱峰，這表明游離脂肪的存在，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是由于油滴的部分聚集[28]，而在TGase改性產(chǎn)物乳狀液3 次循環(huán)中，其在20 ℃左右出現(xiàn)的放熱峰較緩。這也說(shuō)明TGase改性產(chǎn)物在凍融循環(huán)中表現(xiàn)得更加穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

TGase對(duì)SPI的改性可以提高其乳狀液體系的凍融穩(wěn)定性。不同TGase交聯(lián)時(shí)間、添加量改性的SPI乳狀液具有不同的凍融穩(wěn)定性。改性蛋白在制備條件為TGase交聯(lián)時(shí)間3 h、添加量1.5%時(shí)穩(wěn)定性較好，在3 次凍融循環(huán)后，該改性蛋白制備的乳化劑其分層系數(shù)、出油率分別為16.11%、15.59%，而SPI分層系數(shù)及出油率分別為52.15%、48.74%，所以相較于SPI作為乳化劑的乳化體系其凍融穩(wěn)定性得到很大提高。TGase的改性會(huì)對(duì)SPI乳狀液體系凍融過(guò)程中熱特性產(chǎn)生影響，使SPI形成較大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)聚集體，蛋白組成的改變影響乳狀液凍融穩(wěn)定性。本研究拓寬了豆基食品在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍。