鄒 睿，張凌晶,2，鐘 嬋，翁 凌,2，林麗云，李鈺金，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.泰祥集團(tuán) 山東省海洋食品營養(yǎng)研究院，山東 榮成 264309）

貽貝屬于雙殼類海洋軟體動(dòng)物、瓣鰓綱、貽貝科，有較高的營養(yǎng)價(jià)值和一定的藥用價(jià)值。近年來，我國貽貝產(chǎn)量不斷增長，2016年已達(dá)87.9萬 t[1]，尤其在山東、浙江、福建等沿海省份，貽貝已成為一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類。

貝類肌肉中存在的副肌球蛋白（paramyosin，PM）是一種較為特殊的肌原纖維蛋白，常見于無脊椎動(dòng)物中，在脊索動(dòng)物中較為罕見[2]。研究表明，PM位于無脊椎動(dòng)物粗肌絲的核心組成部分，與粗肌絲的伸縮運(yùn)動(dòng)有關(guān)，是一種重要結(jié)構(gòu)蛋白[3-5]。無脊椎動(dòng)物肌肉中PM含量的高低會(huì)顯著影響其質(zhì)構(gòu)。有研究報(bào)道，在蝦夷扇貝閉殼肌中，PM含量高的平滑肌質(zhì)地更加脆硬[6]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，諸如血吸蟲、塵螨等多種寄生蟲PM具有顯著抗原特性，能夠在人及牲畜體內(nèi)引起較強(qiáng)的過敏反應(yīng)[7-9]。Suzuki等[10]通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在軟體動(dòng)物中，除原肌球蛋白（tropomyosin，TM）外，PM也是一種主要的過敏原，且兩者之間存在IgE交叉反應(yīng)性。

貝類肌肉中PM豐度高，在肌原纖維中的相對(duì)含量可達(dá)20%～40%[11]，但目前國內(nèi)外對(duì)其研究仍較少。前期研究對(duì)來源于皺紋盤鮑的PM進(jìn)行分離純化并對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探討[12]。本研究擬以我國高產(chǎn)的翡翠貽貝為研究對(duì)象，從其肌肉中分離純化PM，并對(duì)PM在模擬胃腸液中的消化穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期為貝類深加工以及PM的后續(xù)研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活翡翠貽貝（每只帶殼均質(zhì)量（35±5）g）購買于廈門集美菜市場，放置冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，在4 ℃冷庫內(nèi)開殼后取其肌肉置于冰上，并于2 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白 美國New England Biolabs公司；豬胃蛋白酶（酶活力250 U/mg）、牛胰凝乳蛋白酶（酶活力40 U/mg） 美國Sigma公司；豬胰蛋白酶（酶活力250 U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；Protein A Sepharose 美國GE Healthcare公司；5 mL羥基磷灰石預(yù)裝柱 美國Bio-Rad公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG美國Pierce公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT 2500 E組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；Avanti JA-25高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；G-BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司；Fluor Chem Q化學(xué)發(fā)光成像儀 法國Alpha Innotech公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysics公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白含量的測定

利用微量蛋白核酸測定儀對(duì)層析過程中樣品的吸光度A220nm及A280nm進(jìn)行測定。參照Bradford等[13]方法對(duì)用于模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)的蛋白進(jìn)行定量測定，并對(duì)樣品蛋白濃度作適當(dāng)調(diào)整。將40 μL樣品與2 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染料室溫反應(yīng)5 min后，測定其在595 nm波長處的吸光度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次。

1.3.2 樣品的制備與純化

肌原纖維的提取參照Cao Minjie等[14]的方法，其他純化步驟主要參考Suzuki等[10]方法，并作適當(dāng)調(diào)整。將新鮮貽貝肌肉切碎后稱質(zhì)量，加入料液比1∶10（g/mL）的冰冷緩沖液A（10 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），含0.5 mmol/L L-半胱氨酸和0.15 mol/L NaCl，pH 6.8），搗碎。4 ℃、8 000×g離心10 min，棄去上清液，取沉淀，重復(fù)此操作5～6 次。最后一次獲得的沉淀中加適量緩沖液B（10 mmol/L PBS，含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇，pH 6.8）充分溶解后，4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清液，即得到肌原纖維蛋白。在上清液中加入MgCl2至終濃度1.5 mmol/L，4 ℃攪拌12 h后20 000×g離心30 min。收集上清液，進(jìn)行15%～25%硫酸銨鹽析，所得沉淀加適量緩沖液B溶解后并充分透析于緩沖液B。樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣于羥基磷灰石層析柱，用緩沖液B對(duì)未吸附部分進(jìn)行流洗，吸附部分蛋白用10～200 mmol/L的緩沖液（含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇，pH 6.8）進(jìn)行線性洗脫，最終得到純化的PM。

1.3.3 質(zhì)譜鑒定

將純化的PM進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），考馬斯亮藍(lán)染色后對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行切膠回收，并用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，將酶解片段進(jìn)行串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為800～4 000 Da。在一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果中選擇信噪比大于50的肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，所得數(shù)據(jù)于NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肽段序列檢索。質(zhì)譜鑒定過程委托上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心完成。

1.3.4 兔抗PM多克隆抗體的制備

制備抗體的PM來源于皺紋盤鮑，參考游銀川等[12]方法從皺紋盤鮑肌肉中獲得純化的PM，并免疫新西蘭大白兔制備兔抗PM多克隆抗體。將1 mg/mL純化PM與等體積的弗氏完全佐劑充分混合后對(duì)成年新西蘭雄兔進(jìn)行皮下注射，完成初次免疫。間隔2 周后將PM與等體積弗氏不完全佐劑充分混合并對(duì)兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫3 次后，取少量兔耳動(dòng)脈血清檢測其效價(jià)及特異性，指標(biāo)達(dá)到要求后進(jìn)行頸動(dòng)脈取血。取得的血液在4 ℃靜置4 h后，4 ℃、8 000×g離心15 min，收集血清。免疫過程委托廈門大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

利用Protein A Sepharose親和層析柱對(duì)血清中的IgG抗體進(jìn)行純化。將血清與0.1 mol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸（tris(hydroxymethel) aminomethane-HCl，Tris-HCl，pH 8.0）緩沖液等體積混合后上樣于Protein A Sepharose親和層析柱，依次用0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液和10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液對(duì)未吸附部分進(jìn)行流洗，吸附部分用0.1 mol/L甘氨酸-HCl（pH 3.0）緩沖液進(jìn)行洗脫并收集，立即用0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）中和，最終得到純化的兔抗PM多克隆抗體。

1.3.5 PM的熱變性溫度及熱穩(wěn)定性分析

以梯度降低透析外液濃度的方式對(duì)純化PM進(jìn)行脫鹽，最終將樣品以超純水充分透析。利用圓二色譜測定PM的熱變性溫度，以超純水作為空白對(duì)照。掃描波長范圍為185～260 nm，掃描溫度為20～90 ℃。

通過水浴加熱的方式對(duì)純化PM的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在500 μL離心管中加入等量PM，將樣品分別置于30～100 ℃水浴鍋中加熱30 min，加熱完畢后立即冷卻至室溫。以體積比3∶1向樣品中加入4×SDS緩沖液，95 ℃加熱10 min完成SDS化，低速離心后取上清液進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.3.6 PM的pH值穩(wěn)定性分析

先配制一系列相同濃度（0.2 mol/L）、不同pH值（3～11）的緩沖液（含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇），再取等量的PM分別加入到不同pH值的緩沖液中，充分混勻后置于4 ℃孵育1 h。結(jié)束后立即95 ℃加熱10 min完成SDS化，低速離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.7 貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化

參照美國藥典[15]的方法配制模擬胃、腸液，對(duì)貽貝肌肉蛋白進(jìn)行體外模擬胃腸液總消化實(shí)驗(yàn)，參考萬楚君等[16]方法，并在其基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整。新鮮貽貝肌肉經(jīng)100 ℃加熱10 min后切碎，以料液比1∶10（g/mL）加入0.25 mol/L NaCl溶液進(jìn)行組織搗碎，后置于冰上間歇20 s，重復(fù)此操作4～5 次，直至肌肉被充分搗碎，Bradford法測得其質(zhì)量濃度為8.5 mg/mL。所用消化酶分別為豬胃蛋白酶（250 U/mg）、豬胰蛋白酶（250 U/mg）及牛胰凝乳蛋白酶（40 U/mg），配制3 種酶使其質(zhì)量濃度均為0.85 mg/mL。取300 μL肌肉勻漿樣品與等體積不含胃蛋白酶的模擬胃液（pH 1.2）混合，加入60 μL胃蛋白酶，37 ℃反應(yīng)60 min后，加入25 μL 濃度為1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.5。此后，在樣品中加入60 μL胰蛋白酶并反應(yīng)120 min，繼續(xù)加入60 μL胰凝乳蛋白酶再反應(yīng)120 min，然后將樣品在95 ℃加熱5 min，終止反應(yīng)。

1.3.8 PM的模擬胃液消化

對(duì)PM的消化穩(wěn)定性分析主要參考Huang Yuanyuan等[17]的方法。模擬胃液消化過程中所用酶為胃蛋白酶，活力及用量與上述貽貝肌肉總蛋白消化一致。將200 μL PM樣品與200 μL不含胃蛋白酶的模擬胃液混勻后，加入40 μL胃蛋白酶，在37 ℃反應(yīng)0、1、5、10、15、30、45、60 min時(shí)取出60 μL樣品，加入5 μL NaOH溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)照組加入等量不含胃蛋白酶的模擬胃液。

1.3.9 PM的模擬腸液消化

分別用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對(duì)PM進(jìn)行模擬腸液消化穩(wěn)定性分析，反應(yīng)體系與模擬胃液消化一致，酶與PM質(zhì)量比均為1∶50，反應(yīng)時(shí)間分別為0、5、15、30、60、120、180、240 min，對(duì)照組加入等量不含酶的模擬腸液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，Adobe Illustrator CS5軟件處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM分離純化結(jié)果

由圖1、2可知，貽貝肌原纖維蛋白中的PM經(jīng)過飽和度15%～25%硫酸銨鹽析后得到富集，再經(jīng)過羥基磷灰石柱層析后，目標(biāo)蛋白在PBS濃度為0.15 mol/L左右時(shí)被洗脫下來，SDS-PAGE結(jié)果顯示為單一條帶，分子質(zhì)量約為99.5 kDa。

圖1 翡翠貽貝PM的羥基磷灰石柱層析Fig. 1 Elution curve of PM from Perna viridis by hydroxyapatite chromatography

圖2 PM的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE profile of PM

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

將純化的PM經(jīng)胰蛋白酶酶切后得到肽段的一級(jí)質(zhì)譜圖，其中每個(gè)峰代表一個(gè)肽段（圖3）。將所得數(shù)據(jù)在NCBI上進(jìn)行序列檢索，得到26 個(gè)肽段，共計(jì)330 個(gè)氨基酸殘基（表1）。

圖3 翡翠貽貝PM肽質(zhì)量指紋一級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 PMF of purified PM digested by trypsin

如圖4所示，翡翠貽貝PM的肽段與地中海貽貝PM序列[18]的一致性為100%，與太平洋牡蠣[19]及盤鮑PM[20]序列一致性分別為77%和72%，表現(xiàn)出較高的同源性，證明純化的蛋白即為PM。分析地中海貽貝PM氨基酸組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，其芳香族氨基酸含量極低，其中色氨酸（W）數(shù)量為1，酪氨酸（Y）數(shù)量為14，苯丙氨酸（F）數(shù)量為5，該蛋白在280 nm波長處的吸光度低。這也是在純化PM時(shí)需在220 nm波長處進(jìn)行蛋白檢測的原因。

圖4 翡翠貽貝PM與盤鮑（Haliotis discus discus）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）以及地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）PM的序列比對(duì)Fig. 4 Peptide alignment of PM from Perna viridis with those from Haliotis discus discus, Crassostrea gigas and Mytilus galloprovincialis

表1 翡翠貽貝PM質(zhì)譜所得肽段序列Table 1 Peptide sequences of PM

續(xù)表1

2.3 PM的二級(jí)結(jié)構(gòu)及變性溫度分析

圖5 加熱對(duì)PM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（A）及其熱變性溫度（B）Fig. 5 Effects of temperature on secondary structure of PM (A) and its thermal denaturation temperature (B)

由圖5可知，PM呈現(xiàn)典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。加熱會(huì)導(dǎo)致其正、負(fù)吸收峰值減少，溫度回復(fù)之后其吸收峰值基本恢復(fù)至原值，表明在該加熱過程中，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化是可逆的（圖5A）。其熱變性溫度為（56.3±0.2）℃（圖5B）。

2.4 PM的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性分析

將貽貝PM經(jīng)過30～100 ℃熱處理30 min，低速離心后，對(duì)其上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，由圖6可知，蛋白條帶濃度并沒有發(fā)生明顯變化，表明PM的熱穩(wěn)定性良好。

圖6 PM的熱穩(wěn)定性分析Fig. 6 Thermostability of PM

由圖7可知，PM在pH值為6～11范圍內(nèi)均能夠保持較好的穩(wěn)定性。但當(dāng)pH值為5時(shí)，PM出現(xiàn)部分聚集沉淀現(xiàn)象，pH值低至3～4時(shí)，聚集沉淀現(xiàn)象更為明顯，低速離心后上清液中的蛋白量明顯減少，說明PM在中性條件下穩(wěn)定性良好，但在酸性條件下不穩(wěn)定。

圖7 PM在不同pH值的穩(wěn)定性分析Fig. 7 pH stability of PM

2.5 貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化結(jié)果

圖8 貽貝肌肉蛋白模擬胃腸液消化的SDS-PAGE（A）和Western blot分析（B）結(jié)果Fig. 8 SDS-PAGE (A) and Western blot analysis (B) of simulated gastrointestinal digests of Perna viridis muscle proteins

從圖8可以看出，貽貝肌肉蛋白經(jīng)過不同的酶消化后，均發(fā)生不同程度的降解。經(jīng)過胃蛋白酶消化后，大部分蛋白都已被降解，但分子質(zhì)量在30～130 kDa的降解片段依然存在。經(jīng)過胰蛋白酶消化后，絕大部分蛋白被降解成小分子片段。經(jīng)胰凝乳蛋白酶消化后，這些片段被進(jìn)一步降解，但最后仍有分子質(zhì)量為30 kDa左右的部分小片段未被完全消化。利用兔抗皺紋盤鮑PM多克隆抗體對(duì)各階段的消化產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，這些未降解的條帶均來源于PM。

2.6 模擬胃液和腸液消化穩(wěn)定性分析

圖9 PM模擬胃、腸液消化的SDS-PAGE分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of simulated gastrointestinal digests of PM

由圖9a可知，PM原始片段在1 min之內(nèi)就被胃蛋白酶全部降解成分子質(zhì)量約為80 kDa的片段。隨著時(shí)間延長，該片段逐漸被降解成小分子片段。但在反應(yīng)60 min后，80 kDa的片段仍沒有被全部降解，并且在70 kDa及55 kDa的位置產(chǎn)生較穩(wěn)定的片段，表明PM是一種比較耐胃蛋白酶消化的蛋白。

與模擬胃液消化結(jié)果相比，在模擬腸液消化過程中，PM會(huì)被降解成更多更小的片段。從圖9b可以看出，PM的原始片段在短時(shí)間內(nèi)就被胰蛋白酶全部降解，并且在55～72 kDa區(qū)間內(nèi)產(chǎn)生降解片段。隨著時(shí)間的延長，這些片段也被進(jìn)一步消化，但即便反應(yīng)240 min后，PM依然未被完全消化，在分子質(zhì)量約為52 kDa處產(chǎn)生一穩(wěn)定的片段，而最小可見蛋白條帶的分子質(zhì)量約為43 kDa。胰凝乳蛋白酶對(duì)PM的降解程度與胰蛋白酶較為相似，SDS-PAGE圖中最小可見蛋白條帶的分子質(zhì)量約為45 kDa（圖9c），表明PM對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶也具有較高的耐受性。

3 討 論

貝類、頭足類等水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中的PM是一種典型的鹽溶性蛋白，只溶于高鹽緩沖液，在低鹽環(huán)境下易析出。周茹等[21]對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白的鹽離子濃度依賴性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，當(dāng)鹽濃度≤0.4 mol/L時(shí)，肌原纖維蛋白中的PM以及其他蛋白的溶解性會(huì)隨著鹽濃度的升高而增大；在0.4～0.8 mol/L內(nèi)，隨著鹽濃度的上升，原肌球蛋白與肌球蛋白重鏈的相對(duì)含量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，而PM相對(duì)含量會(huì)略有減少。因此，為提高PM的純化效果，本研究在Suzuki等[10]純化PM的方法（PBS中的鹽濃度為0.9 mol/L）基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，將PBS鹽濃度調(diào)整為0.5 mol/L，在保證PM有較高的溶解性的同時(shí)避免過多鹽溶性雜蛋白的融入。

Suzuki等[10]對(duì)6 種軟體動(dòng)物肌肉的鹽溶性蛋白進(jìn)行100 ℃熱抽提10 min后，發(fā)現(xiàn)PM含量大幅減少，而TM無明顯變化，因此認(rèn)為，PM熱穩(wěn)定性較TM差，會(huì)因熱變性而形成沉淀。Zhu Beiwei等[22]在研究加熱對(duì)鮑魚肌肉質(zhì)構(gòu)和顯微結(jié)構(gòu)的影響研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度升至50 ℃時(shí)，肌肉中PM含量隨著溫度的上升逐漸減少。而本研究對(duì)純化翡翠貽貝PM的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，PM經(jīng)過100 ℃加熱30 min后并沒有沉淀產(chǎn)生。圓二色譜分析也顯示雖然在高溫下PM的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，但溫度恢復(fù)后，其結(jié)構(gòu)也隨之恢復(fù)（圖5），這表明在低于100 ℃的條件下，PM的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化是可逆的，該蛋白是一種耐熱蛋白。實(shí)際上，PM是一種肌球蛋白結(jié)合型蛋白[23-25]，而肌球蛋白對(duì)熱非常不穩(wěn)定，這也解釋了為何肌肉蛋白抽提液中的PM會(huì)因?yàn)榧訜岫冃猿恋恚兓疨M對(duì)熱穩(wěn)定。

分析PM在酸性環(huán)境下容易聚集沉淀的原因，是由于溶液pH值接近PM等電點(diǎn)，導(dǎo)致其分子所帶電荷減少，分子之間的排斥力減弱，從而聚集產(chǎn)生沉淀。游銀川等[12]利用雙向電泳測得皺紋盤鮑PM等電點(diǎn)為5.4，通過生物信息學(xué)分析獲得地中海貽貝（BAA36517.1，Mytilus galloprovincialis）PM等電點(diǎn)為5.0，這與本研究的結(jié)果相近。

對(duì)貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胃蛋白酶消化后，肌肉中的主要結(jié)構(gòu)蛋白（肌球蛋白重鏈、PM、肌動(dòng)蛋白）均發(fā)生明顯的降解，并產(chǎn)生大量降解條帶。這些降解條帶繼而被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解成分子質(zhì)量更小的片段，但在反應(yīng)結(jié)束后依然有少量未被完全消化，免疫印跡檢測表明未消化的條帶均來源于PM。本研究室前期研究報(bào)道了生鮮、煮制、干制、罐制4 種加工方式制備的皺紋盤鮑肌肉經(jīng)模擬胃腸液消化后，所有蛋白被完全降解[16]，與本研究結(jié)果有一定差異。除物種差異性外，分析原因可能是對(duì)鮑魚的研究中所使用的胰蛋白酶活力（325 U/mg）、胰凝乳蛋白酶活力（59.3 U/mg）及反應(yīng)時(shí)間（4 h）均高于本研究，因此酶解程度較本研究會(huì)更徹底。

對(duì)PM的模擬胃、腸液消化穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，PM在3 種酶的消化作用下分別呈現(xiàn)不同的降解趨勢，該結(jié)果與張凌晶等[26]報(bào)道的太平洋牡蠣肌原纖維蛋白的模擬胃、腸液消化過程中PM的降解趨勢較為相似。本研究中，胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶單獨(dú)消化均未能將PM完全降解。只有在3 種酶連續(xù)作用下其降解才較為有效，說明PM是貽貝肌肉中最難被消化的，這可能與PM穩(wěn)定結(jié)構(gòu)有關(guān)。圓二色譜（圖5）分析顯示PM的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，α-螺旋依靠氫鍵維持其穩(wěn)定性。在組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，脯氨酸由于其亞氨基少一個(gè)氫原子，無法形成氫鍵，因此是α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞者。分析地中海貽貝PM序列發(fā)現(xiàn)，該蛋白僅有1 個(gè)脯氨酸殘基，因此，非常有利于其形成穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)。有研究指出，PM在天然狀態(tài)下由2 條單體互相纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)[25]，這種二聚體形式也在一定程度上增加其對(duì)酶水解的抗拒性。但在胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶3 種酶的連續(xù)作用下，因?yàn)槊盖形稽c(diǎn)的增加，與單一酶水解相比，效率大大增加。

已有研究表明，在軟體動(dòng)物肌肉中，除主要過敏原TM外，PM也是一種過敏原。TM因其較高的熱穩(wěn)定性以及耐消化性，在免疫學(xué)領(lǐng)域一直備受學(xué)者們的關(guān)注[27-29]。PM與TM盡管在分子質(zhì)量和一級(jí)結(jié)構(gòu)序列上有較大差異，它們具有相似的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，還具有相似的IgE結(jié)合活性[10]、氨基酸組成[20,30]以及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征等[31-33]。因此，對(duì)貝類PM的研究有待進(jìn)一步深入。