劉顯庭，秦倩，羅潔，任發(fā)政

（1.中糧置地管理有限公司，北京 100020；2.中國青年政治學院，北京 100089；3.中國農(nóng)業(yè)大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

凝乳形成過程及其流變與結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究進展

劉顯庭1，秦倩2，羅潔3，任發(fā)政3

（1.中糧置地管理有限公司，北京 100020；2.中國青年政治學院，北京 100089；3.中國農(nóng)業(yè)大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

凝乳是干酪、酸奶等乳制品生產(chǎn)的關鍵環(huán)節(jié)。凝乳形成過程及凝乳性質(zhì)對乳制品的質(zhì)構(gòu)、風味等產(chǎn)品特征都會產(chǎn)生影響。本文歸納了目前國內(nèi)外有關凝乳的研究，介紹了凝乳形成的原理、不同凝乳的流變與結(jié)構(gòu)性質(zhì)，為乳制品的開發(fā)與生產(chǎn)提供參考。

酸凝乳；酶凝乳；酸酶共促凝乳；流變；結(jié)構(gòu)

凝乳是指牛乳酪蛋白膠束在凝乳酶、酸或熱誘導等因素作用下交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠的過程，是干酪、酸奶等乳制品生產(chǎn)的關鍵環(huán)節(jié)[1]。乳制品特定的質(zhì)構(gòu)、風味與凝乳形成過程及凝乳性質(zhì)息息相關，人們在生產(chǎn)凝乳制品的過程中，多靠控制凝乳過程及性質(zhì)來達到控制產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)與風味特征的目的。因此，凝乳一直以來是國內(nèi)外研究的熱點。

1 凝乳形成的過程

依據(jù)凝乳過程中酪蛋白膠束穩(wěn)定性的破壞原理不同，可將凝乳分為凝乳酶作用誘導形成的酶凝乳，酸化誘導形成的酸凝乳以及凝乳酶與酸化共同作用誘導形成的酸酶共促凝乳。切達干酪、布里干酪、姜撞奶等由酶凝乳方式生產(chǎn)，農(nóng)家干酪、夸克干酪、奶油干酪、新疆奶疙瘩、蒙古奶豆腐等由酸凝乳方式生產(chǎn)，部分大塊型干酪（例如大塊型農(nóng)家干酪、夸克干酪）由酸酶共促凝乳方式生產(chǎn)[2]。

1.1 酶凝乳形成過程

目前，超過75%的干酪是以酶凝乳的方式生產(chǎn)，且所有需要經(jīng)過成熟的干酪都是通過酶凝乳方式生產(chǎn)的。酶凝乳是牛乳經(jīng)標準化、巴氏殺菌、均質(zhì)等前處理，并酸化至一定pH時，加入特定的凝乳酶使牛乳繼續(xù)酸化與酶解形成凝塊的過程。牛乳中酪蛋白膠束通過表面帶負電荷的毛發(fā)層產(chǎn)生空間位阻作用，使膠束結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定存在，而凝乳酶通過特異性地水解κ-酪蛋白肽鏈的Phe105和Met106之間的肽鍵，釋放親水C端的酪蛋白巨肽，降低了膠束的穩(wěn)定性，使凝塊形成[3]。根據(jù)目前文獻報道，可以將酶凝乳的形成過程分為兩個階段（圖1），而在實際生產(chǎn)中兩個階段重疊、同時發(fā)生。

圖1 酶凝乳形成的兩個階段

目前關于階段一的研究報道已經(jīng)有較清楚的認識[4]。階段一發(fā)生的變化是酪蛋白的水解。當凝乳酶作用于酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白，會使105～106位的苯丙氨酸和蛋氨酸之間的肽鍵發(fā)生水解，產(chǎn)生N端的副κ-酪蛋白和C端的酪蛋白巨肽（或酪蛋白糖巨肽）。這一過程直接導致了酪蛋白膠束之間靜電斥力和空間位阻作用的降低。有研究表明，酪蛋白膠束粒徑的大小對酶凝乳形成具有顯著性影響，酪蛋白粒徑越小，則形成的凝乳強度越大[5]。同時，酪蛋白巨肽共有9種，所有的酪蛋白巨肽都能在2%的三氯乙酸中溶解，僅糖基化的酪蛋白巨肽能在高濃度的三氯乙酸中溶解[6]。因此，三氯乙酸可溶性氮的含量可作為觀測第一階段發(fā)生的指標。

階段二的變化是酪蛋白的聚集。經(jīng)過凝乳酶的作用形成的糖巨肽是可溶的，可以直接釋放到乳清當中。當85%以上的酪蛋白被分解時，且溫度大于20℃時，副κ-酪蛋白在乳中鈣離子的作用下，彼此之間形成“鈣橋”，使副κ-酪蛋白相互凝聚，最終產(chǎn)生凝膠[7]。

1.2 酸凝乳形成過程

酸凝乳是利用乳酸菌發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)酸或添加食用酸使原乳pH值下降從而誘導酪蛋白膠束聚集。有關酸凝乳形成的機理一直以來都是研究的熱點，目前研究者提出了酸凝乳的數(shù)學模型，如膠球模型、分形模型等[8]，盡管對這些模型存在爭議，但對酸化過程中的基本結(jié)構(gòu)變化達成了共識。

圖2 酸化對酪蛋白膠束內(nèi)外鈣、磷平衡的影響[9,10]

與酶解作用于酪蛋白膠束表面不同，酸化不僅作用于表面，還作用于膠束內(nèi)部。牛乳的pH一般為6.7左右，酪蛋白以酪蛋白-磷酸鈣復合體形式存在于牛乳溶膠中。酸凝乳酸化的pH約為4.6，即酪蛋白的等電點[11]。小角度X散射試驗表明，pH由6.6降到5.3時，膠束內(nèi)磷酸鈣逐漸釋放[12]。pH 5.2時，所有磷酸鹽溶解，進一步酸化至pH4.6，鈣離子完全釋放，從而影響酪蛋白膠束內(nèi)外鈣、磷平衡（如圖2所示）。盡管磷酸鈣釋放使酪蛋白之間的磷酸根基團鍵合作用消失，使酪蛋白單體所帶電荷隨pH減小而降低，但酪蛋白膠束并不發(fā)生解離[13]。Ouanezar等人[14]利用原子力顯微鏡觀察了酪蛋白膠束酸化前后的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明酸化后膠束粒徑減小，酪蛋白失去表面異構(gòu)性，對礦物質(zhì)含量與表面負電荷更為敏感。因此，在單一酸化條件下凝乳的性質(zhì)可通過調(diào)節(jié)pH而控制。

1.3 酸酶共促凝乳形成過程

在牛乳酸化至一定pH值時，加入少量的凝乳酶，使酸化與凝乳酶共同作用誘導凝乳的形成，即酸酶共促凝乳。由于酸酶共促凝乳過程中涉及導致酪蛋白膠束聚集的兩個因素——酸化與酶解，且其影響因素包括切割pH、蛋白濃度、凝乳時的溫度及鈣離子添加量等[15]，使得凝乳的影響因素更為復雜，從而加大了研究的難度。目前有關酸酶共促凝乳的機制尚未明確，有關研究集中在酸酶共促凝乳過程中的流變等表觀性質(zhì)方面。

由于酸化與凝乳酶交互作用，酸酶共促凝乳形成過程較為復雜。根據(jù)相關文獻，可將酸酶共促形成凝乳的過程分為以下階段[16]：①加入發(fā)酵劑或化學酸，使牛乳酸化至凝乳酶所需的pH。②加入一定量的凝乳酶，凝乳酶作用的第一階段開始，κ-酪蛋白被特異性水解。③凝乳酶作用進入第二階段，酪蛋白膠束發(fā)生聚集，促使凝膠形成。④隨著pH降低，酶凝型凝膠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗崮湍z，并伴隨微量的脫水。⑤在持續(xù)酸化作用下，酸凝作用占主導作用，酸凝膠形成。⑥脫水收縮作用增加，酪蛋白收縮，導致微孔收縮（無乳清析出），接著產(chǎn)生大量的脫水收縮（可見乳清析出）。

表1 凝乳流變學性質(zhì)研究中的主要參數(shù)及其意義[18]

通過調(diào)節(jié)酸化劑與凝乳酶濃度，結(jié)合不同的原料比配比，可以實現(xiàn)特定凝乳的控制。Liu等通過構(gòu)建量化的酸與凝乳酶作用理想模型，比較了不同酸化與酶解凝乳的流變與結(jié)構(gòu)學性質(zhì)，將酸酶共促凝乳分為酸凝型凝膠、酶凝型凝膠及酸破壞型酶凝膠[17]。因此，進一步探究酸酶共促凝乳形成的過程對于研發(fā)新型干酪與指導實際生產(chǎn)具有重要意義。

2 凝乳的流變性質(zhì)

凝乳為黏彈性聚合物，具有理想固體或液體的特征，可以表征為流變學彈性或黏性參數(shù)。流變學通過振蕩剪切應力或者應變掃描，可以得到凝乳形成過程及凝膠的信息，包括表示每振蕩周期儲存能量大小的G′，每振蕩周期散失能量大小的G′′，及二者之間的比值tanδ。這些參數(shù)與聚合物大分子間的相互作用、凝膠微觀結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)品的最終感官品質(zhì)有關[1]。因此，流變實驗被廣泛應用于凝乳的研究中。

目前，凝乳的流變學研究主要分為凝乳過程與凝塊的流變學性質(zhì)兩部分。凝乳過程的流變學性質(zhì)研究多通過時間掃描等小形變實驗，分析彈性模量、損耗正切值等隨時間的變化[18]，其具體定義及意義如表1所示。小振幅振蕩實驗是指在剪切應變小于1%的范圍內(nèi)，凝膠結(jié)構(gòu)在剪切作用下不破壞，在剪切應變作用下，測定相應的剪切應力的變化。凝乳過程中彈性模量的變化可以表征酪蛋白聚集快慢與酪蛋白分子重排作用的強弱。G′是衡量樣品剪切過程中每周期儲存能量多少的指標，G′越大則樣品越趨向于固體，其大小能反映樣品中鍵的數(shù)目與強度，G′越小則鍵的強度越弱或數(shù)量越少[18]。tanδ是黏性模量與彈性模量之間的比值，其大小能表征凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)重排作用的強弱，從而反映凝乳的穩(wěn)定性，tanδ越大則重排作用越強，凝塊結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。凝乳過程中一般以tanδ=1.0或G′=1Pa時對應的時間作為凝乳時間，以表征凝乳進行的快慢。

凝塊方面，多通過頻率掃描實驗或大形變實驗測定凝塊對應力或應變的響應[19]。大形變實驗是剪切應力達到最大值或者恒定剪切速率下的掃描實驗，得到的屈服應力值或應變值反映凝膠的可塑性及切割、咬食特性。屈服應力值是大形變實驗掃描下，樣品黏度值突然降低的一點所對應的剪切應力的大小。屈服應力值的大小能反映凝膠的易破碎程度，屈服應力越小則表明凝乳越容易破碎，且凝乳中蛋白間的相互作用鍵合強度、數(shù)目、弛豫時間以及方向都與屈服應力相關[20]。對于凝乳來說，凝塊頻率掃描下，彈性模量與頻率之間一般呈冪律指數(shù)關系，冪律模型常用作比較不同凝膠之間黏彈性質(zhì)的“指紋圖譜”，流動性良好的樣品符合冪律模型[1]。

時間掃描下，彈性模量隨著時間的變化可以監(jiān)測凝乳的過程，其變化趨勢可以表征酪蛋白聚集快慢與酪蛋白分子重排作用的強弱。研究表明，由于疏水作用力的增加，凝乳開始時彈性模量隨著時間變化而逐漸增大[21]。在酶凝乳過程中，彈性模量隨著凝乳時間的增加而逐漸增大，最后達到一個平穩(wěn)值，在85～95Pa之間（如表2所示）。而損耗正切值則隨凝乳時間增加而逐漸減小至平穩(wěn)值，小于0.35。在酸凝乳過程中，隨著凝乳的形成，彈性模量也隨之增大，可達200～220Pa，損耗正切值增加至0.5～0.54之間。

表2 酸凝乳與酶凝乳流變性質(zhì)比較[1]

然而，對于典型的酸酶共促凝乳，其凝乳過程為彈性模量隨酸化的進行先增大到第一個極大值，再稍微降低至極小值，最后再次增大。對應的損耗正切值呈現(xiàn)先迅速減小，然后緩慢增大至極大值，最后持續(xù)降低的趨勢。根據(jù)Lucey等人[22]的研究結(jié)果，以pH5.2為分界點可將酸酶共促凝乳分為兩個階段，即當pH＞5.2時，凝乳流變學性質(zhì)更趨向于酶凝乳，凝乳主要為酶解作用所主導；當pH＜5.2時，則更趨向于酸凝乳，凝乳為酸化作用主導。在pH=5.2時，酸酶共促凝乳有非常高的滲透系數(shù)與損耗正切值，表明酪蛋白之間的相互鍵合作用逐漸弛緩。因此酸酶共促凝乳的過程是由酶凝型凝乳逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗崮湍榈倪^程。

3 凝乳的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

凝乳的結(jié)構(gòu)性質(zhì)指直接觀察到的酪蛋白網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)特征與脫水收縮作用強弱所間接反映的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。其中，凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性與孔徑大小決定了干酪等乳制品的質(zhì)地特征，而酪蛋白之間的鏈接與融合程度對其影響最大。自發(fā)性脫水收縮作用是凝乳結(jié)構(gòu)內(nèi)局部壓力作用的結(jié)果，表現(xiàn)為凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定與乳清析出量增加[23]。有研究表明，脫水收縮作用對乳制品的生產(chǎn)具有重要意義，脫水收縮作用的強弱與速度影響著乳制品的水分、酸度、質(zhì)地、風味等特征。酪蛋白膠束在脫水收縮過程中的分子重排作用加快了凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)收縮及凝塊乳清析出[14]?？刂泼撍湛s作用對于改善乳制品的品質(zhì)具有重要作用。

目前，凝乳微觀結(jié)構(gòu)的觀察多采用激光共聚焦掃描顯微鏡與電鏡掃描兩種手段。其中，雖然電子掃描顯微鏡很早就已廣泛應用于乳制品凝乳過程的研究，但是其觀察需要對樣品進行多步處理，包括化學固定、脫水干燥、樹脂嵌入、切片、著色等過程，且這些處理將影響樣品的微觀結(jié)構(gòu)，增大實驗誤差。激光共聚焦顯微鏡克服了這一弱點，近些年來逐漸應用于食品微觀結(jié)構(gòu)的觀察，其具有以下特點：樣品前期處理少、時間短，無損條件下可獲得凝乳三維圖像，通過熒光染色特定觀察結(jié)構(gòu)組分，并可持續(xù)觀察凝乳過程[24]。但是其分辨率為0.2μm，無法觀察單個酪蛋白分子的結(jié)構(gòu)。因此，凝乳微觀結(jié)構(gòu)觀察中往往根據(jù)不同目的采用不同的觀察手段。

酶凝乳是高度集中的基質(zhì)，包括：副к-酪蛋白磷酸鈣脫水網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，副к-酪蛋白融合；脂肪球被包裹在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)；水分、乳糖、乳酸、礦物質(zhì)、水溶性肽、酶類等可溶性物質(zhì)被副к-酪蛋白包埋；以發(fā)酵劑、乳酸菌為主的微生物吸附在脂蛋白表面。其中，蛋白質(zhì)成分越高，副к-酪蛋白融合程度越高，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的體積分數(shù)越高。酸凝乳與酶凝乳的組成成分基本相同，包含蛋白質(zhì)、脂肪及水分。但是，二者在微觀結(jié)構(gòu)方面有區(qū)別，主要區(qū)別于以下幾點[2]：①酸凝乳結(jié)構(gòu)由酪蛋白組成，而酶凝乳結(jié)構(gòu)由膠體磷酸鈣通過架橋作用聚合的副к-酪蛋白組成。②由于酸凝乳形成過程中，pH降低至4.5～4.8，膠體磷酸鈣大量溶解，且隨著乳清的析出而排出，因此，酸凝乳中酪蛋白之間的鈣橋作用顯著減弱。③酸凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的容積率較低，酪蛋白彼此之間的融合程度較低，使得酪蛋白含量較低，水分含量增加，從而使得酸凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較弱。④酸凝乳中的脂肪球聚合程度較低，因此脂肪球較小。有研究指出，對于奶油干酪等產(chǎn)品來說，均質(zhì)過程有利于酸凝乳的形成。⑤對于大多數(shù)酸凝乳，在切割和/或凝膠破壞后，凝乳顆粒物迅速濃縮，加之水分含量較高導致顆粒物失去其特性，融合形成結(jié)構(gòu)上無縫的連續(xù)物，因此，形成的干酪產(chǎn)品無宏觀上的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)的較為均勻。

目前，對酶凝乳脫水收縮過程及其影響因素研究較多，而對酸酶共促凝乳只有少量研究報道。根據(jù)Steven等人[25]的報道，在酸化初期加入少量凝乳酶時，酸化加快了凝乳酶的酶解作用，使得凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)粗糙，凝乳強度增大。隨著pH值的進一步降低，凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸形成（圖3），酸酶共促凝乳在脫水收縮作用過程中，凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的酪蛋白逐漸緊密鏈接或發(fā)生融合作用。由于酪蛋白之間發(fā)生融合，酸酶共促凝乳經(jīng)后期攪拌后，較酸凝乳將更加黏稠。Steven等人利用核磁共振技術實時監(jiān)測了凝乳過程，在pH 5.15時，凝乳形成，此時結(jié)構(gòu)類似于酸凝乳即孔徑較小的球狀酪蛋白。當pH降到4.78時，凝乳結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，凝乳的孔徑增大，分叉更為明顯。酪蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由大的酪蛋白聚集物構(gòu)成，表明小的酪蛋白分子之間已經(jīng)發(fā)生融合。酸化24h后，凝乳pH達到4.56，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中空隙明顯。

圖3 酸酶共促凝乳與酸凝乳結(jié)構(gòu)的對比[25]

在酸凝乳或酶凝乳中，凝乳的結(jié)構(gòu)學性質(zhì)與流變學性質(zhì)存在一定的關聯(lián)，即高tanδ值說明凝乳脫水收縮作用更強，乳清析量大[18]，從而使得酪蛋白融合加強，凝乳孔徑增大。然而，酸酶共促凝乳中tanδ與凝乳結(jié)構(gòu)的關系尚不清楚。Castillo等人[26]的研究表明，凝乳的脫水收縮作用與酸化程度及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成中，凝乳形成時間、tanδ值大小等指標呈相關性，且凝乳動態(tài)與脫水收縮動態(tài)具有明顯的交互作用，溫度與光散射參數(shù)建立的數(shù)學模型可準確預測乳清的動態(tài)析出量。因此，可通過此模型建立監(jiān)測凝乳與脫水收縮的動態(tài)變化，以控制乳制品的最終品質(zhì)。有關凝乳結(jié)構(gòu)學性質(zhì)的研究表明，凝乳微觀結(jié)構(gòu)與發(fā)酵劑濃度、凝乳酶濃度、酪蛋白濃度、膠體磷酸鈣的釋放量等因素有關，發(fā)酵劑濃度越大，凝塊脫水收縮作用速度與強度越小、網(wǎng)狀孔徑越小[27]。

4 結(jié)語與展望

目前，對酸凝乳與酶凝乳的機制已有較為清楚的闡述。然而，由于酸酶共促凝乳過程中涉及導致酪蛋白膠束聚集的兩個因素——酸化與酶解，使得凝乳過程與凝塊性質(zhì)的影響因素更為復雜。在此過程中，酸化與酶解持續(xù)伴隨進行而無法得到量化控制，酸化與酶解作用各自對酸酶共促凝乳的貢獻難以區(qū)分，從而加大了研究的難度[19,25,27,28]。目前有關酸酶共促凝乳的研究多基于模擬酸酶共促凝乳過程，研究凝乳的流變學與結(jié)構(gòu)學性質(zhì)，但對酸酶共促凝乳機制的研究尚未闡釋清楚，有關酸酶共促對凝乳及酪蛋白膠束特性的影響尚不明確。

未來，可以通過模擬溫度等環(huán)境條件構(gòu)建量化的酸化與凝乳酶作用的模型，控制酸化與凝乳酶的作用程度，比較不同酸化與酶解程度下牛乳流變學與結(jié)構(gòu)學性質(zhì)，進一步明確酸化與凝乳酶作用對凝乳形成的貢獻，從而為凝乳制品的開發(fā)奠定基礎。

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Advances in Milk Gels Formation and Its Rheological and Structural Properties

LIU Xian-ting1, QIN Qian2, LUO Jie3, REN Fa-zheng3
(1.Cofco Land Management Co. Ltd., Beijing 100020; 2.China Youth University of Political Stuidies, Beijing 100089; 3.The Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health, China Agricultural University,Beijing 100083)

Milk gels formation is a crucial step in the manufacture of dairy product. Milk gels can be produced by acid or rennet, resulting in dairy product with different rheological and structural properties. In this study we reviewed the researches about milk gels formaiton which has been extensively studied. We introduced the gels formation methods and their theories, rheological and structural properties of gels.

Acid induced gels; Rennet induced gels; Combined acid and rennet induced gels; Rheology; Structure

TS252.1

A

1004-4264（2017）07-0053-06

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.07.014

2017-01-17

本研究受云南省科技計劃生物重大專項（奶業(yè)專項）（2014ZA001）支持。

劉顯庭（1988-），男，漢族，碩士。

任發(fā)政（1962-），男，漢族，教授，研究方向為乳品科學。